细胞模型建立与基因操作
验证ITGB8-AS1在CRC细胞中的表达水平，并建立敲低和过表达的细胞模型以研究其功能。
在多种CRC细胞系和正常结肠上皮细胞中检测ITGB8-AS1表达，选取HCT116和DLD-1，使用shRNA敲低或质粒过表达ITGB8-AS1。
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lncRNA ITGB8-AS1作为ceRNA通过整合素介导的黏着斑信号促进结直肠癌生长和迁移
lncRNA ITGB8-AS1 functions as a ceRNA to promote colorectal cancer growth and migration through integrin-mediated focal adhesion signaling
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型、患者来源异种移植（PDX）模型、临床样本分析、转录组测序及分子机制验证（ceRNA网络、双荧光素酶报告、RNA免疫沉淀等）多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
CRC细胞系（HCT116和DLD-1） BALB/c裸鼠异种移植瘤模型（HCT116细胞） 结直肠癌患者来源异种移植（PDX）模型 CRC肝转移PDX来源细胞（CRC-LM PDC）模型
重点核对
ITGB8-AS1敲低或过表达后细胞增殖（CCK-8）、集落形成、迁移（Transwell、伤口愈合）变化 ITGB8-AS1敲低后肿瘤生长（异种移植瘤）和肝脏转移（PDC模型）变化 IGB8-AS1敲低后ITGA3、ITGB3表达及SRC/ERK/p38 MAPK磷酸化水平变化 miR-33b-5p、let-7c-5p、let-7d-5p抑制剂对ITGB8-AS1敲低效应的影响
摘要
长链非编码RNA（lncRNA）在结直肠癌（CRC）的发生和进展中发挥关键作用。然而，大多数lncRNA在CRC中的功能及其分子机制仍未明确。本研究发现lncRNA ITGB8-AS1在CRC中高表达。敲低ITGB8-AS1抑制了CRC细胞的增殖、集落形成和肿瘤生长，提示ITGB8-AS1具有致癌作用。转录组分析及KEGG分析显示，黏着斑信号是受ITGB8-AS1正调控基因中最显著富集的通路。一致地，敲低ITGB8-AS1减弱了SRC、ERK和p38 MAPK的磷酸化。机制上，ITGB8-AS1在细胞质中可海绵吸附miR-33b-5p和let-7c-5p/let-7d-5p，分别调控整合素家族基因ITGA3和ITGB3的表达。使用反义寡核苷酸（ASO）靶向ITGB8-AS1可显著降低CRC细胞增殖和肿瘤生长，表明ITGB8-AS1在CRC中的治疗潜力。此外，ITGB8-AS1在CRC患者血浆中易于检测，其水平与分化程度和TNM分期以及血浆ITGA3和ITGB3水平正相关。总之，ITGB8-AS1作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过调控黏着斑信号调节CRC细胞增殖和肿瘤生长。靶向ITGB8-AS1可有效抑制CRC细胞生长和肿瘤生长。晚期CRC中检测到ITGB8-AS1血浆水平升高。因此，ITGB8-AS1可作为CRC的潜在治疗靶点和循环生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究lncRNA ITGB8-AS1在结直肠癌中的功能及其分子机制，并评估其作为治疗靶点和循环生物标志物的潜力。
- 核心机制
- ITGB8-AS1作为竞争性内源RNA（ceRNA），在细胞质中海绵吸附miR-33b-5p和let-7c-5p/let-7d-5p，分别上调整合素ITGA3和ITGB3的表达，进而激活整合素介导的黏着斑信号通路（包括SRC、ERK和p38 MAPK的磷酸化），促进CRC细胞增殖、迁移和肿瘤生长。
- 主要证据
- 基于CRC细胞系（HCT116、DLD-1）的敲低和过表达实验（CCK-8、集落形成、Transwell、伤口愈合）、异种移植瘤模型和PDX模型，结合RNA-seq和KEGG分析、Western blot验证整合素及其下游信号，双荧光素酶报告和Ago2 RIP验证ceRNA机制，以及临床样本和血浆检测。
- 研究意义
- ITGB8-AS1可作为CRC的潜在治疗靶点（ASO靶向抑制有效）和循环生物标志物（血浆水平与分化、TNM分期及ITGA3/ITGB3正相关），为CRC的诊断和预后提供了新线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
评估ITGB8-AS1对CRC细胞增殖、集落形成和迁移能力的影响。
通过CCK-8、集落形成、Transwell和伤口愈合实验检测ITGB8-AS1敲低或过表达对细胞增殖和迁移的影响。
体内肿瘤生长实验
验证ITGB8-AS1在体内对肿瘤生长的影响。
将稳定敲低ITGB8-AS1的HCT116细胞皮下注射到BALB/c裸鼠，测量肿瘤重量；使用ASO处理荷瘤小鼠评估治疗潜力。
转录组分析
鉴定受ITGB8-AS1调控的基因和信号通路。
对siITGB8-AS1和siCTL处理的HCT116细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因并进行KEGG通路富集分析。
机制验证：ceRNA网络
验证ITGB8-AS1是否作为ceRNA调控整合素基因表达。
通过生信预测ceRNA网络，结合双荧光素酶报告实验、Ago2 RIP、qRT-PCR和Western blot验证ITGB8-AS1与miRNA及靶基因的相互作用。
临床样本分析
评估ITGB8-AS1在CRC组织及血浆中的表达及其与临床特征的相关性。
qRT-PCR检测CRC组织和血浆中的ITGB8-AS1水平，并分析其与病理参数（分化、TNM分期等）及ITGA3/ITGB3血浆水平的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| L15培养基 | -- | -- | |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素和链霉素 | HyClone | -- | |
| 基因敲低和过表达 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 嘌呤霉素 | Invitrogen | -- | |
| pLKO.1载体 | -- | -- | |
| ITGB8-AS1 shRNA | RiboBio | -- | |
| ITGB8-AS1反义寡核苷酸 | RiboBio | -- | |
| ITGB8-AS1 siRNA | RiboBio | -- | |
| ITGB8-AS1过表达质粒 | Mailgene | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| RNA提取和qRT-PCR | RNAiso Plus | Takara | -- |
| RNAiso Blood | Takara | -- | |
| All-In-One RT MasterMix | Abm | -- | |
| AriaMx实时荧光定量PCR仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Western blot | CytoBuster蛋白提取试剂 | Merck Millipore | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Applygen | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | BioFroxx | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| 抗p-SRC抗体 | Cell Signal Technology | 6943 | |
| 抗p-ERK抗体 | Cell Signal Technology | 4370 | |
| 抗p-p38 MAPK抗体 | Cell Signal Technology | 4511 | |
| 抗SRC抗体 | Cell Signal Technology | 2109 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signal Technology | 4695 | |
| 抗p38 MAPK抗体 | Cell Signal Technology | 8690 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signal Technology | 5174 | |
| 抗兔二抗 | Cell Signal Technology | 7074 | |
| 抗鼠二抗 | Cell Signal Technology | 7076 | |
| Ago2 RIP | 3× FLAG标记的AGO2质粒 | -- | -- |
| RNasin RNase抑制剂 | Promega | -- | |
| 氧钒核糖核苷复合物溶液 | Sigma | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | -- | |
| 抗FLAG M2琼脂糖 | Sigma | -- | |
| 蛋白酶K | Ambion | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | psiCHECK2载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| Spark多功能酶标仪 | Tecan | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Vital River Laboratories | -- |
| 胰蛋白酶/EDTA | Gibco | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 |
| RNA-FISH | ITGB8-AS1 FISH探针 | RiboBio | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| Triton X-100 | Amresco | -- | |
| 预杂交缓冲液 | ZSJB-BIO | -- | |
| 玻璃底培养皿 | NEST | -- | |
| RNA-seq | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Illumina HiSeq测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HCT116和DLD-1细胞需在指定培养基（McCoy's 5A和RPMI 1640）中培养，添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，37°C、5% CO2。 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and cell culture |
| 基因敲低和过表达 | 使用ITGB8-AS1 shRNA（pLKO.1载体）敲低，或ITGB8-AS1过表达质粒（Mailgene）进行转染。 阅读提示：Materials and methods: Gene knockdown and overexpression |
| 体外功能实验 | CCK-8实验需使用Dojindo CCK-8试剂盒，并在450 nm处读取吸光度。 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation, colony formation, and migration assays |
| 体内肿瘤生长实验 | 使用雌性BALB/c裸鼠（约6周龄），皮下接种1×10^8 cells/mL的HCT116细胞（100 μL），每组5只。 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |
| ASO治疗实验 | NC-ASO和ITGB8-AS1-ASO以10 nM/瘤的浓度通过瘤内注射给药，每3天一次，共21天。 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments |
| RNA-seq | siRNA转染48小时后收集细胞，RNA-seq由Illumina HiSeq平台完成，差异基因筛选阈值为fold change > 1.5，q < 0.05。 阅读提示：Materials and methods: RNA-seq and data analysis |
| 双荧光素酶报告实验 | 使用psiCHECK2载体构建野生型和突变型报告质粒，与miRNA mimics共转染HCT116细胞36小时，测定荧光素酶活性。 阅读提示：Materials and methods: Luciferase reporter assay |
| Ago2 RIP | 使用3× FLAG标记的AGO2质粒转染细胞，以FLAG或IgG抗体进行免疫沉淀，检测ITGB8-AS1和miRNA的富集。 阅读提示：Materials and methods: Ago2 RIP |
| 临床样本分析 | CRC组织和血浆样本采集及处理方式需遵循伦理委员会批准方案。 阅读提示：Materials and methods: Clinical specimens |