单细胞RNA测序鉴定果蝇血液中的新型细胞类型

Single-cell RNA sequencing identifies novel cell types in Drosophila blood

作者信息Yulong Fu, Xiaohu Huang, Peng Zhang, Joyce van de Leemput, Zhe Han
PMID32487456
发布时间2020-04
DOI10.1016/j.jgg.2020.02.004

实验完整度

包含单细胞RNA测序、体外细胞鉴定、基因功能验证(RNAi)和细菌感染实验,涉及多种独立证据层次。

主要模型

果蝇(w1118株)循环血细胞 Tep4-Gal4>UAS-Tep4-RNAi果蝇 人类外周血单核细胞(PBMCs)

重点核对

样本来源:w1118株18只三龄幼虫循环血细胞 scRNA-seq平台:10x Chromium,测序参数:26bp Read1、8bp I7、98bp Read2 细胞过滤标准:基因数大于200且小于2500 细菌感染剂量:P. luminescens OD600=0.1,P. asymbiotica、M. luteus、S. aureus、L. monocytogenes OD600=0.25,E. coli OD600=0.015 统计显著性:P<0.05

摘要

果蝇已被广泛用于模拟人类血液-免疫系统,因为这两个系统共享许多发育和免疫反应机制。然而,虽然已经鉴定出许多人类血细胞类型,但在果蝇中仅发现三种:浆细胞、晶体细胞和片层细胞。为了更好地理解果蝇血液系统的复杂性,我们使用单细胞RNA测序技术生成了果蝇循环血细胞的全面基因表达谱。除了已知的细胞类型外,我们鉴定出两种新的果蝇血细胞类型:thanacytes和primocytes。Thanacytes表达许多刺激反应基因,参与对不同类型细菌的独特反应。Primocytes表达细胞命运决定和信号传导基因,似乎参与维持血液中的干细胞。此外,我们的数据揭示了四种新的浆细胞亚型(Ppn+、CAH7+、Lsp+和储备浆细胞),每种亚型具有独特的分子身份和不同的预测功能。我们还鉴定了从果蝇血细胞到人类血细胞的跨物种标志物。我们的分析揭示了更复杂的果蝇血液系统,并拓宽了使用果蝇模拟人类血液系统在发育和疾病中的范围。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
果蝇血液系统中是否存在更多未被发现的细胞类型和亚型?
核心机制
Thanacytes通过特异性表达Tep4参与对不同类型细菌的差异性免疫反应;Primocytes可能作为造血前体细胞维持干细胞特性。
主要证据
scRNA-seq鉴定出两种新细胞类型和四种浆细胞亚型;免疫荧光和转基因系验证标记;Tep4-RNAi实验证明thanacytes对特定细菌的差异反应;跨物种分析发现人类同源基因表达。
研究意义
揭示果蝇血液系统的复杂性,为利用果蝇模型研究人类血液系统发育和疾病提供更广泛的依据。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

单细胞转录组分析

鉴定果蝇循环血细胞的异质性

从18只w1118三龄幼虫收集循环血细胞,使用10x Chromium平台进行scRNA-seq,经过数据过滤和聚类分析。

2

浆细胞亚型分析

根据转录组特征将浆细胞分类为亚型并预测其功能

对浆细胞簇进行无偏亚聚类,结合单细胞轨迹分析和GO通路分析。

3

新细胞类型鉴定与标记验证

验证scRNA-seq鉴定的thanacytes和primocytes,并确认其特异性标记

使用免疫荧光和转基因果蝇品系验证标记基因表达,包括Ance-GFP、Tep4-Gal4>UAS-mCD8-GFP等。

4

Thanacyte功能研究

评估thanacytes对不同类型细菌感染的免疫反应

通过Tep4-Gal4驱动UAS-Tep4-RNAi特异性沉默thanacytes中的Tep4,感染不同细菌并监测存活率。

5

跨物种比较

寻找果蝇血细胞与人类血细胞之间的功能保守性

使用DIOPT寻找人类同源基因,并在公共PBMC数据集中检查表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Chromium单细胞控制器10x Genomics--
GemCode技术10x Genomics--
SPRIselect试剂Beckman Coulter--
Agilent Bioanalyzer高灵敏度试剂盒Agilent--
Qubit双链DNA高灵敏度试剂盒Invitrogen--
Illumina文库定量试剂盒KAPA BiosystemsKK4824
NextSeq测序仪Illumina--
抗Ance抗体----
AlexaFluor 568抗小鼠二抗Thermo Fisher Scientific--
AlexaFluor 568抗兔二抗Thermo Fisher Scientific--
藤黄微球菌ATCC#4698
单核细胞增生李斯特菌ATCC#19115
NanoDrop 2000c分光光度计Thermo Fisher Scientific--
Cell Ranger10x Genomics--
Fiji----
ZEN 2Zeiss--
GraphPad Prism 7.00GraphPad Software--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
单细胞RNA测序
样本数量(18只)和发育阶段(三龄幼虫);细胞悬液制备在冰上Schneider培养基;细胞计数用Neubauer计数板;数据过滤标准(200-2500个基因);聚类参数(Seurat版本、PC选择)
阅读提示:Methods: Sample preparation and single-cell RNA sequencing; Data preparation, dimensionality reduction and cell clustering
浆细胞亚型分析
亚聚类方法(Seurat)、轨迹分析参数(Monocle2、前1000个差异基因)、GO分析数据库(DAVID)和阈值(调整后P<0.05)
阅读提示:Methods: Differentially expressed genes and gene ontology (GO) analysis; Cell trajectory analysis of plasmatocytes using Monocle
免疫荧光
固定条件(4%甲醛10分钟);抗体来源和稀释比例(文中未明确说明);成像设备(Apotome)
阅读提示:Methods: Immunofluorescence
细菌感染实验
细菌培养条件(温度、转速、时间);感染剂量(OD600);注射体积(20 nL);果蝇年龄(7-10天);每组果蝇数量(40只);监测时间(96小时)
阅读提示:Methods: Bacterial infection and survival experiments
跨物种分析
直系同源预测工具(DIOPT 7.1);人类数据来源(Zheng et al. 2017);序列比对工具(CLUSTAL O 1.2.4)
阅读提示:Methods: Expression of human homologs of the differentially expressed Drosophila genes in PBMCs