单细胞转录组分析
鉴定果蝇循环血细胞的异质性
从18只w1118三龄幼虫收集循环血细胞,使用10x Chromium平台进行scRNA-seq,经过数据过滤和聚类分析。
Single-cell RNA sequencing identifies novel cell types in Drosophila blood
包含单细胞RNA测序、体外细胞鉴定、基因功能验证(RNAi)和细菌感染实验,涉及多种独立证据层次。
果蝇(w1118株)循环血细胞 Tep4-Gal4>UAS-Tep4-RNAi果蝇 人类外周血单核细胞(PBMCs)
样本来源:w1118株18只三龄幼虫循环血细胞 scRNA-seq平台:10x Chromium,测序参数:26bp Read1、8bp I7、98bp Read2 细胞过滤标准:基因数大于200且小于2500 细菌感染剂量:P. luminescens OD600=0.1,P. asymbiotica、M. luteus、S. aureus、L. monocytogenes OD600=0.25,E. coli OD600=0.015 统计显著性:P<0.05
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定果蝇循环血细胞的异质性
从18只w1118三龄幼虫收集循环血细胞,使用10x Chromium平台进行scRNA-seq,经过数据过滤和聚类分析。
根据转录组特征将浆细胞分类为亚型并预测其功能
对浆细胞簇进行无偏亚聚类,结合单细胞轨迹分析和GO通路分析。
验证scRNA-seq鉴定的thanacytes和primocytes,并确认其特异性标记
使用免疫荧光和转基因果蝇品系验证标记基因表达,包括Ance-GFP、Tep4-Gal4>UAS-mCD8-GFP等。
评估thanacytes对不同类型细菌感染的免疫反应
通过Tep4-Gal4驱动UAS-Tep4-RNAi特异性沉默thanacytes中的Tep4,感染不同细菌并监测存活率。
寻找果蝇血细胞与人类血细胞之间的功能保守性
使用DIOPT寻找人类同源基因,并在公共PBMC数据集中检查表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞测序 | Chromium单细胞控制器 | 10x Genomics | -- |
| GemCode技术 | 10x Genomics | -- | |
| SPRIselect试剂 | Beckman Coulter | -- | |
| Agilent Bioanalyzer高灵敏度试剂盒 | Agilent | -- | |
| Qubit双链DNA高灵敏度试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Illumina文库定量试剂盒 | KAPA Biosystems | KK4824 | |
| NextSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | 抗Ance抗体 | -- | -- |
| AlexaFluor 568抗小鼠二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| AlexaFluor 568抗兔二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细菌感染 | 藤黄微球菌 | ATCC | #4698 |
| 单核细胞增生李斯特菌 | ATCC | #19115 | |
| NanoDrop 2000c分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 数据处理 | Cell Ranger | 10x Genomics | -- |
| 图像分析 | Fiji | -- | -- |
| ZEN 2 | Zeiss | -- | |
| 统计绘图 | GraphPad Prism 7.00 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 样本数量(18只)和发育阶段(三龄幼虫);细胞悬液制备在冰上Schneider培养基;细胞计数用Neubauer计数板;数据过滤标准(200-2500个基因);聚类参数(Seurat版本、PC选择) 阅读提示:Methods: Sample preparation and single-cell RNA sequencing; Data preparation, dimensionality reduction and cell clustering |
| 浆细胞亚型分析 | 亚聚类方法(Seurat)、轨迹分析参数(Monocle2、前1000个差异基因)、GO分析数据库(DAVID)和阈值(调整后P<0.05) 阅读提示:Methods: Differentially expressed genes and gene ontology (GO) analysis; Cell trajectory analysis of plasmatocytes using Monocle |
| 免疫荧光 | 固定条件(4%甲醛10分钟);抗体来源和稀释比例(文中未明确说明);成像设备(Apotome) 阅读提示:Methods: Immunofluorescence |
| 细菌感染实验 | 细菌培养条件(温度、转速、时间);感染剂量(OD600);注射体积(20 nL);果蝇年龄(7-10天);每组果蝇数量(40只);监测时间(96小时) 阅读提示:Methods: Bacterial infection and survival experiments |
| 跨物种分析 | 直系同源预测工具(DIOPT 7.1);人类数据来源(Zheng et al. 2017);序列比对工具(CLUSTAL O 1.2.4) 阅读提示:Methods: Expression of human homologs of the differentially expressed Drosophila genes in PBMCs |