Uli-epic策略建立与验证
建立并验证Uli-epic文库构建策略的可行性和准确性。
将Uli-epic应用于常规RNA-seq，用1 ng和100 pg mRNA建库，与常规RNA-seq（20 ng）比较基因表达相关性，并评估检测基因数、覆盖率等。
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Uli-epic：从超低投入样本中分析RNA修饰
Uli-epic: profiling RNA modifications from ultra-low input samples
实验完整度
高包含方法开发、体外细胞验证、动物模型（FGR小鼠）以及组织样本（NSC和精子）的多层级实验，并进行了功能验证和机制探索。
主要模型
HEK 293T细胞系 胎儿生长受限（FGR）小鼠模型 小鼠神经干细胞（NSC） 小鼠精子
重点核对
RNA投入量：Uli-epic BID-seq为100 pg-1 ng，Uli-epic GLORI为10 ng 化学处理条件：BID-seq使用亚硫酸氢盐处理，GLORI使用乙二醛和亚硝酸盐处理 线性扩增步骤：T7 RNA聚合酶介导的体外转录 测序平台和读长：MGI T7平台，双端100 bp 差异修饰位点的统计阈值：Ψ为绝对变化≥20%，p<0.05；m6A为绝对变化≥15%，p<0.05
摘要
High-throughput sequencing with chemical labeling enables robust, transcriptome-wide detection of RNA modifications at single-nucleotide resolution. However, these methods typically require substantial RNA amounts due to harsh treatments. We introduce Uli-epic, an innovative library construction strategy that enables profiling epitranscriptomic modifications using 100 pg to 1 ng of RNA. Utilizing Uli-epic BID-seq, we investigate pseudouridine (Ψ) sites in neural stem cells and sperm RNA from wild-type and fetal growth restriction mice, using only 500 pg of rRNA-depleted RNA. Uli-epic GLORI quantifies m6A in sperm and neural stem cells from wild-type and fetal growth restriction mice, using 10 ng of rRNA-depleted RNA.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种能对超低投入RNA进行表观转录组修饰分析的文库构建策略，并用于揭示FGR小鼠NSC和精子中Ψ和m6A的修饰图谱。
- 核心机制
- Uli-epic策略通过poly(A)加尾、逆转录模板转换和T7 RNA聚合酶介导的线性扩增，实现对超低投入RNA的化学处理兼容和信号放大。
- 主要证据
- 在HEK 293T细胞中，Uli-epic BID-seq使用100 pgRNA即可检测到Ψ位点，且与常规BID-seq（20 ng）一致性高；Uli-epic GLORI使用10 ngRNA检测m6A，与常规GLORI（200 ng）位点重叠率高。
- 研究意义
- 该方法将RNA修饰检测的投入量降低至皮克级，为临床样本和稀有样本的表观转录组研究提供了工具，并为FGR相关认知障碍和跨代遗传的分子机制提供了潜在的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Uli-epic BID-seq验证
验证Uli-epic与BID-seq结合后，在超低投入RNA中检测Ψ的准确性和敏感性。
对HEK 293T mRNA分别用BID-seq（20 ng）和Uli-epic BID-seq（1 ng和100 pg）处理，加入Ψ对照RNA，比较检测到的Ψ位点数目、stoichiometry、分布特征等。
Uli-epic GLORI验证
验证Uli-epic与GLORI结合后，在超低投入RNA中检测m6A的准确性和敏感性。
对HEK 293T mRNA分别用GLORI（200 ng）和Uli-epic GLORI（10 ng）处理，加入m6A对照RNA，比较m6A位点数量、stoichiometry、motif等。
FGR小鼠模型建立
建立FGR小鼠模型，用于研究FGR条件下NSC和精子RNA修饰的变化。
通过给怀孕小鼠喂食低蛋白饮食（8%蛋白）建立FGR模型，正常饮食（20%蛋白）作为对照。
NSC和精子RNA修饰图谱分析
比较WT和FGR小鼠NSC和精子中Ψ和m6A的修饰图谱，并鉴定差异修饰位点。
从FGR和WT小鼠的NSC（胚胎17.5天）和精子中提取rRNA去除的总RNA，进行Uli-epic BID-seq和Uli-epic GLORI，分析Ψ和m6A位点及其差异，并进行GO富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MycAway™ Plus-Color一步法支原体检测试剂盒 | Yeasen | -- |
| 高糖DMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | SLAC Laboratory Animal Company | -- |
| Nestin-GFP小鼠 | -- | -- | |
| 精子收集 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 体细胞裂解缓冲液 | -- | -- | |
| NSC分选 | 神经组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-628 |
| Hibernate™-A培养基 | Invitrogen | A1247501 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Biogems | 64010-00-100 | |
| DAPI | Solarbio | C0060 | |
| BD FACS Aria II流式细胞分选仪 | BD | -- | |
| RNA提取 | VAHTS mRNA捕获磁珠 | Vazyme | N401 |
| Ribo-off rRNA去除试剂盒 | Vazyme | N406 | |
| 常规RNA-seq | T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201S |
| T4 RNA连接酶2（截短KQ） | NEB | M0373S | |
| 5'脱腺苷酶 | NEB | M0331S | |
| RecJf核酸外切酶 | NEB | M0247S | |
| SuperScript™ III逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
| T4 RNA连接酶1（高浓度） | NEB | M0437M | |
| Uli-epic RNA-seq | 大肠杆菌Poly(A)聚合酶 | NEB | M0276 |
| Oligo Clean & Concentrator试剂盒 | Zymo Research | D4061 | |
| SuperScript™ IV模板转换RT预混液 | Thermo Fisher | A65423 | |
| 大肠杆菌RNase H | NEB | M0297L | |
| Q5热启动高保真预混液 | NEB | M0494 | |
| 核酸外切酶I | NEB | M0293S | |
| T7高产RNA转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman | B23318 | |
| Uli-epic GLORI | 乙二醛溶液 | Sigma-Aldrich | 50649 |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201S | |
| Uli-epic BID-seq | RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | -- |
| RNA脱磺酸缓冲液 | Zymo Research | R5001-3-40 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Uli-epic BID-seq | RNA投入量：100 pg-1 ng；BID处理条件：70°C 3小时；逆转录酶和条件：模板转换酶Mix，42°C 90分钟；线性扩增：T7 High Yield RNA Transcription Kit；测序深度：30-100 G 阅读提示：Methods: Uli-epic BID-seq |
| Uli-epic GLORI | RNA投入量：10 ng；GLORI处理条件：50°C 30分钟，16°C 8小时；逆转录酶和条件：模板转换酶Mix，42°C 90分钟；线性扩增：T7 High Yield RNA Transcription Kit；测序深度：约160 G 阅读提示：Methods: Uli-epic GLORI |
| FGR模型 | 饮食：正常（20%蛋白）或蛋白限制（8%蛋白）；喂养时间：0.5 dpc至分娩 阅读提示：Methods: Experimental animals |
| NSC样本制备 | 小鼠品系：Nestin-GFP；胚胎龄：17.5天；流式分选：Nestin阳性细胞；RNA提取：TRIzol 阅读提示：Methods: Purification of dentate neural progenitors |
| 精子样本制备 | 小鼠年龄：10-12周；精子来源：附睾尾；体细胞裂解：0.1% SDS, 0.5% Triton X-100，冰上40分钟；RNA提取：TRIzol 阅读提示：Methods: Sperm sample collection |