LR-Split-seq技术开发和比较
评估LR-Split-seq在不同引物策略（oligo-dT vs 随机六聚体）和不同样本类型（细胞 vs 细胞核）中的性能。
构建1000细胞亚库，进行PacBio长读长和Illumina短读长测序，比较读长分布、基因检测、转录本分类，并分析细胞与细胞核差异。
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在单细胞分辨率下利用LR-Split-seq绘制和建模差异性RNA异构体表达的基因组基础
Mapping and modeling the genomic basis of differential RNA isoform expression at single-cell resolution with LR-Split-seq
实验完整度
高包含LR-Split-seq、短读长Split-seq、bulk长读长RNA-seq、snATAC-seq、RNA velocity和空间转录组等多项技术，并进行了技术比较和功能验证。
主要模型
C2C12成肌细胞 C2C12成肌细胞核 分化的C2C12肌管（72h 72小时）
重点核对
使用C2C12细胞系，达到90-100%融合度后以含2%马血清和1μM胰岛素的培养基诱导分化3天 LR-Split-seq采用Parse Biosciences的固定试剂盒和全转录组试剂盒，以及PacBio Sequel II测序 短读长Split-seq使用Illumina NextSeq 500，平均每条9000细胞文库测序深度5100万reads，1000细胞文库7000万reads snATAC-seq使用Bio-Rad SureCell ATAC-seq试剂盒，每个样本300,000细胞（活力>90%）进行标签化
摘要
长读长测序的通量和质量的提升应能明确识别全长转录异构体。然而，其在单细胞RNA-seq中的应用受限于通量和成本。在此，我们开发并表征了长读长Split-seq（LR-Split-seq），该方法利用组合条形码技术以长读长测序单细胞。应用于C2C12成肌系统，LR-Split-seq以相对经济且设计灵活的方式将异构体与细胞类型相关联。我们发现分化过程中广泛存在异构体表达变化的证据，包括选择性转录起始位点（TSS）和/或选择性内部外显子使用。LR-Split-seq为识别单细胞中簇特异性异构体提供了一种经济的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发一种经济、灵活的单细胞长读长RNA-seq方法，以在单细胞分辨率下鉴定和定量RNA异构体，并揭示分化过程中的异构体调节？
- 核心机制
- C2C12成肌分化过程中，大量基因发生异构体转换，包括Tpm2和Pkm，涉及替代TSS和/或内部外显子使用；TSS转换与染色质可及性变化相协调，如Tnnt2。
- 主要证据
- LR-Split-seq在C2C12 0小时肌母细胞和72小时分化细胞中鉴定出广泛差异表达异构体和TSS，并通过短读长Split-seq、bulk RNA-seq、snATAC-seq及RNAscope验证。
- 研究意义
- LR-Split-seq为单细胞异构体分析提供了经济且可扩展的方法，可灵活整合短读长和长读长测序，用于研究复杂组织中的细胞类型和状态。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞聚类和细胞类型鉴定
验证LR-Split-seq能否复现短读长Split-seq鉴定出的细胞类型和分化状态。
对464个细胞/核进行基因水平的Leiden聚类和UMAP分析，比较短读长和长读长的聚类结果，并检查已知标记基因的表达模式。
大规模短读长Split-seq分析
在更大规模的细胞群体中确认亚群结构，并揭示Pax7hi和Myoghi等分化状态的异质性。
对36,869个细胞/核进行短读长Split-seq，进行Leiden聚类（20个簇），RNA velocity分析，并用RNAscope验证标记基因的空间表达。
snATAC-seq分析
评估分化过程中染色质可及性的变化，并识别肌源相关调控元件。
对23,525个细胞核进行snATAC-seq，进行Leiden聚类（18个簇），并使用Signac与RNA数据整合，分析标记峰和GO富集。
TSS鉴定和差异TSS使用分析
从LR-Split-seq数据中鉴定TSS，并测试不同细胞群间差异TSS使用以揭示异构体调节。
使用ENCODE PacBio TSS caller从长读长和短读长数据中调用TSS，与外部数据集验证，并进行差异TSS测试（MB vs Pax7hi, MB vs Myoghi）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Omega Scientific | FB-11 |
| 供体马血清 | Gibco | 16050130 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），1x | HyClone | SH30256.02 | |
| TrypLE Express 分散酶 | Gibco | 12605010 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Tris-HCl，pH 8 | Thermo Scientific | AM9855G | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher Scientific | S271 | |
| 氯化镁（MgCl2） | Sigma | M8266 | |
| IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific | 28324 | |
| SUPERase In RNase抑制剂 | Invitrogen | AM2694 | |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9937 | |
| 台盼蓝 | Bio-Rad | 1450021 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | 文中未明确说明 | -- | |
| Mr. Frosty 冻存盒 | 文中未明确说明 | -- | |
| 单细胞文库制备（Split-seq） | 细胞固定试剂盒 | Parse Biosciences | SB2001 |
| 细胞核固定试剂盒 | Parse Biosciences | SB2001 | |
| 单细胞全转录组试剂盒 | Parse Biosciences | SB2001 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| Agilent生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 测序 | Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
| Sequel II测序仪 | Pacific Biosciences（PacBio） | -- | |
| 长读长文库制备 | SMRTbell模板制备试剂盒 | Pacific Biosciences（PacBio） | 100-938-900 |
| 测序 | SMRT细胞 | Pacific Biosciences（PacBio） | 101-008-000 |
| RNA提取 | RNA-easy试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| snATAC-seq | SureCell ATAC-Seq文库制备试剂盒 | Bio-Rad | 17004620 |
| ddSEQ单细胞分离器 | Bio-Rad | -- | |
| ThermoMixer恒温混匀仪 | Eppendorf | -- | |
| RNAscope | RNAscope HiPlex 12试剂盒 | ACDBio | 324100/324140 |
| 蛋白酶III | ACDBio | 322340 | |
| HybEZ II杂交炉 | ACDBio | 321710/321720 | |
| 湿度控制盘 | ACDBio | 310012 | |
| 10%中性缓冲福尔马林 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 疏水屏障笔 | Vector Laboratories | H-4000 | |
| EVOS FL Auto 2显微镜 | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞培养 | TC20自动细胞计数器 | Bio-Rad | 1450102 |
| Thermo Scientific 10厘米培养皿 | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15毫升聚丙烯锥形管 | VWR | 89039-670 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和分化 | C2C12细胞（ATCC CRL-1772）在含20% FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM中培养，分化时融合度达到90-100%后更换为含2%马血清、1μM胰岛素和1%青霉素-链霉素的培养基，每24小时更换分化培养基，持续3天。 阅读提示：Methods: C2C12 culture and differentiation |
| LR-Split-seq文库制备 | 使用Parse Biosciences的Fixation Kit for Cells/Nuclei和Single Cell Whole Transcriptome Kit，按制造商协议进行固定、透化、三轮条形码逆转录和连接，最终构建1000细胞亚库（扩增20循环）和6个9000细胞亚库（扩增18循环）。 阅读提示：Methods: Preparation of single-cell barcoded cDNA using Split-seq |
| PacBio长读长测序 | 使用500ng扩增的cDNA，按SMRTbell Template Prep Kit制造商协议制备文库，在Sequel II平台上用2个SMRT cells测序，目标深度为5,764,421全长非嵌合reads。 阅读提示：Methods: Preparation of PacBio scRNA-seq library and sequencing |
| 短读长Split-seq测序 | 所有7个亚库均采用Illumina NextSeq 500平台测序，9000细胞文库平均深度5100万reads，1000细胞文库7000万reads，双端run配置74/86/6/0。 阅读提示：Methods: Preparation of Illumina scRNA-seq libraries using Split-seq and sequencing |
| snATAC-seq | 使用Bio-Rad SureCell ATAC-seq试剂盒，按OMNI-ATAC版本制造商协议操作，每个生物重复使用300,000个细胞（活力>90%），标签化在37°C进行30分钟，60000核/重复，使用ddSEQ Single-Cell Isolator。 阅读提示：Methods: Preparation of snATAC-seq libraries using Bio-Rad technology and sequencing |
| RNAscope验证 | 使用RNAscope HiPlex 12试剂盒，探测Col1a1, Itm2a和Myh3基因，杂交2小时，通过多轮信号放大和成像，使用EVOS FL Auto 2显微镜在40倍放大下观察。 阅读提示：Methods: Validation of transcript expression with RNAscope |