功能筛选鉴定化疗增敏miRNA
在神经母细胞瘤细胞系中筛选能增敏低剂量化疗的miRNA。
使用包含1240个miRNA模拟物的文库转染Kelly和SH-EP细胞，并以IC30剂量的阿霉素或长春新碱处理，通过CellTiter-Glo检测细胞活力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
miR-99b-5p、miR-380-3p和miR-485-3p是高风险神经母细胞瘤的新型化疗增敏miRNA
miR-99b-5p, miR-380-3p, and miR-485-3p are novel chemosensitizing miRNAs in high-risk neuroblastoma
实验完整度
高包含功能筛选、体外细胞实验、体内PDX模型、RNA-seq、qRT-PCR、Western blot及荧光素酶报告实验等多层级验证。
主要模型
MYCN扩增的Kelly细胞系 患者来源细胞系COG-N-519 COG-N-519患者来源异种移植（PDX）小鼠模型 临床队列（255例神经母细胞瘤患者）
重点核对
miRNA模拟物转染浓度（25 nM）及化疗药物IC30剂量 细胞系：MYCN扩增的Kelly、SK-N-DZ，非扩增的SH-EP 动物模型：COG-N-519 PDX皮下移植瘤（雌性NSG小鼠） 给药方案：瘤内注射miRNA-纳米颗粒复合物，每次25 μg miRNA+75 μg纳米颗粒，每3天一次，共7天 检测指标：细胞活力、增殖、细胞周期、凋亡、靶基因表达及肿瘤生长
摘要
神经母细胞瘤是一种起源于发育中的交感神经系统的致命儿童癌症。高风险患者目前接受强化化疗，仅对50%的患儿有治愈效果，并给部分幸存患者留下终身副作用。microRNA（miRNA）是神经嵴发育的关键调控因子，在神经母细胞瘤肿瘤发生过程中失调，使得基于miRNA的药物成为一种有吸引力的治疗途径。在神经母细胞瘤细胞系中进行了一项超过1200个miRNA模拟物的功能筛选，以发现可使细胞对低剂量（30%抑制浓度[IC30]）的阿霉素和长春新碱化疗（用于该疾病治疗）敏感的miRNA。三个miRNA（miR-99b-5p、miR-380-3p和miR-485-3p）在多种高风险神经母细胞瘤模型中具有有效的阿霉素化疗增敏活性。这些miRNA在部分神经母细胞瘤患者中发生基因组缺失，低表达预示不良生存结局。体外功能实验表明，这些miRNA均增强了阿霉素的抗增殖和促凋亡作用。我们使用RNA测序（RNA-seq）显示，miR-99b-5p在体外和患者来源异种移植（PDX）肿瘤中均抑制神经母细胞瘤依赖基因LIN28B和PHOX2B。荧光素酶报告实验证明PHOX2B是miR-99b-5p的直接靶标。我们预期，恢复这里发现的肿瘤抑制miRNA的功能可能是治疗神经母细胞瘤患者的一种有价值的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些miRNA能够增敏神经母细胞瘤细胞对化疗药物（阿霉素和长春新碱）的敏感性，并可作为潜在治疗靶点？
- 核心机制
- miR-99b-5p直接靶向并抑制PHOX2B，且可能间接抑制LIN28B，从而增强阿霉素的抗增殖和促凋亡效应，部分通过阻断PHOX2B/LIN28B反馈环路实现。
- 主要证据
- 在Kelly和COG-N-519细胞中，miR-99b-5p、miR-380-3p和miR-485-3p与阿霉素联用显著降低增殖、增加凋亡；RNA-seq显示miR-99b-5p抑制LIN28B和PHOX2B；荧光素酶报告实验验证PHOX2B直接靶向。
- 研究意义
- 恢复这些肿瘤抑制miRNA的功能可能成为治疗神经母细胞瘤的一种有价值的治疗策略，有望降低化疗剂量和毒性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| IMDM培养基 | Gibco | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Sigma | -- | |
| Earl's MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| miRNA筛选 | Dharmacon miRNA模拟物文库 | Dharmacon | -- |
| DharmaFECT 1转染试剂 | Dharmacon | -- | |
| 药物处理 | 阿霉素 | -- | -- |
| 长春新碱 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光检测试剂 | Promega | -- |
| Cytation 3酶标仪 | BioTek | -- | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD | -- | |
| 凋亡检测 | eBioscience Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | miRNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA质量检测 | NanoDrop ND-1000分光光度计 | NanoDrop Technologies | -- |
| Agilent Bioanalyser 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| TapeStation系统 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA-seq文库构建 | TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| RNA测序 | HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA提取（PDX组织） | TissueLyser II组织研磨仪 | Qiagen | -- |
| RNA质量检测（PDX组织） | LabChip GX 24微流控芯片系统 | PerkinElmer | -- |
| RNA-seq文库构建（PDX组织） | KAPA RNA HyperPrep试剂盒 | KAPA | -- |
| 文库定量 | Qubit高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA测序（PDX组织） | NextSeq测序系统 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | -- | |
| QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NuPage上样缓冲液 | Life Technologies | -- | |
| 还原剂 | Life Technologies | -- | |
| Bis/Tris预制胶 | Life Technologies | -- | |
| MOPS电泳缓冲液 | Life Technologies | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| Odyssey封闭缓冲液 | LI-COR | -- | |
| LIN28B抗体 | Cell Signaling Technology | 4196S | |
| PHOX2B抗体 | Santa Cruz | sc-376997 | |
| β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IRDye680或IRDye800荧光二抗 | LI-COR | -- | |
| Odyssey CLx扫描仪 | LI-COR | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 纳米颗粒制备 | miRNA模拟物 | Shanghai GenePharma | -- |
| 星形POEGMA纳米颗粒 | -- | -- | |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Thermo Fisher Scientific | RM-9106 |
| cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9964 | |
| BOND RX自动染色仪 | Leica | -- | |
| Aperio玻片扫描仪 | Leica | -- | |
| 荧光素酶报告实验 | psiCHECK2载体 | Promega | -- |
| XhoI和NotI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| Wizard SV凝胶和PCR纯化柱 | Promega | -- | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | -- | |
| Qiagen质粒大提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测 | Promega | -- | |
| 药物处理 | AZD4547 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基及补充成分，如Kelly和SH-EP使用RPMI+10%FBS，COG-N-519使用IMDM+20%FBS+ITS，SK-N-DZ和HEK-293T使用DMEM+10%FBS 阅读提示：Materials and methods: Cell culture growth conditions |
| miRNA筛选 | miRNA模拟物浓度（25 nM）、转染试剂（DharmaFECT 1）、化疗药物IC30剂量、检测时间点（144小时）及细胞活力检测方法 阅读提示：Materials and methods: High-throughput miRNA screening; Figure 1 legend |
| 体外功能验证 | 细胞系（Kelly、COG-N-519、SK-N-DZ）、miRNA或siRNA浓度、转染试剂、阿霉素处理时间（48和96小时）、增殖检测（IncuCyte）时长（7天）、细胞周期和凋亡检测的染色及分析 阅读提示：Materials and methods: Proliferation assay, Cell-cycle assay, Apoptosis assay, Cell viability assay; Figure 3 legend |
| 体内PDX实验 | 小鼠品系（NSG）、年龄、细胞接种数量、肿瘤体积阈值（100 mm3）、给药方式（瘤内注射）、miRNA-纳米颗粒剂量（25 μg miRNA+75 μg纳米颗粒）、给药间隔（每3天）、治疗时长（7天）及终点分析时间（最后一次注射后24小时） 阅读提示：Materials and methods: Mouse experiments; Figure 5 legend |
| 靶标验证 | RNA-seq生物重复数（4次）、差异表达阈值（FDR<0.05，fold change>1.5）、qRT-PCR内参（RNU48 for miRNA, GAPDH for mRNA）、Western blot内参（β-actin）及抗体稀释度（LIN28B 1:1000，PHOX2B 1:500，β-actin 1:1000） 阅读提示：Materials and methods: RNA-seq of cell lines, RNA-seq analysis, Quantitative real-time PCR analysis, Western blotting; Figures 4 and 5 legends |