鉴定β-catenin相关的环枢纽
是否在结直肠癌细胞中形成多环枢纽结构
在HCT116细胞中通过β-catenin HiChIP鉴定染色质环，并基于至少10个基因互连的标准定义78个环枢纽。
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β-catenin的相分离在结直肠癌中组装活性环枢纽
Phase separation of β-catenin assembles active loop hubs in colorectal cancer
实验完整度
高包含体外相分离实验、细胞系功能实验、患者组织验证及多组学分析（HiChIP、ChIP-seq、CUT&Tag、RNA-seq），并进行了功能缺失验证。
主要模型
HCT116结直肠癌细胞系 SW480结直肠癌细胞系 SW620结直肠癌细胞系 结直肠癌临床组织样本
重点核对
β-catenin HiChIP和H3K4me3 HiChIP的细胞系为HCT116（结直肠癌），以及正常结肠上皮细胞系NCM460作对照 体外相分离实验使用eGFP-β-catenin融合蛋白，在含125 mM NaCl和10% PEG-8000的液滴形成缓冲液中进行 dCas9-APEX2邻近标记实验使用500 μM生物素-苯酚处理30分钟，再加入过氧化氢至终浓度1 mM处理1分钟 FUS或PARP1敲除的HCT116细胞通过CRISPR/Cas9技术构建，并通过Western blot和测序验证 DNA甲基化干扰实验使用dCas9-KRAB-MeCP2系统，靶向环枢纽区域而非基因启动子
摘要
背景：三维基因组组织的异常是癌症的一个标志。然而，其潜在的调控机制仍然难以捉摸。结果：在这里，我们通过HiChIP分析在结直肠癌HCT116细胞中鉴定了β-catenin相关的环枢纽。这些枢纽表现出活跃的转录环境，以升高的基因表达和H3K4me3富集为标志。通过人工DNA甲基化破坏环枢纽的形成抑制了枢纽基因的表达并抑制了结直肠癌的生长，表明其功能重要性。机制上，β-catenin形成与环枢纽密切相关的相分离凝聚体。通过邻近标记和基因组分析，我们鉴定并验证了环枢纽处β-catenin凝聚体中的组分。我们进一步表征了FUS作为β-catenin凝聚体组装的支架，而PARP1通过H3K4me3维持活跃的转录。任一组分的缺失均通过不同的调控机制削弱凝聚体功能。结论：我们的发现揭示了β-catenin凝聚体通过组装更高阶的染色质结构来协调基因调控网络，为相分离、基因组组织和癌症进展之间的机制联系提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- β-catenin在结直肠癌中如何通过相分离调节三维基因组组织，进而协调基因调控网络并促进癌症进展？
- 核心机制
- β-catenin形成相分离凝聚体，其支架蛋白FUS维持凝聚体结构，客户蛋白PARP1通过维持H3K4me3水平保持转录活性，二者协同组装活性环枢纽调控癌症相关基因。
- 主要证据
- β-catenin HiChIP结合H3K4me3 HiChIP、RNA-seq和ChIP-seq在HCT116细胞中鉴定环枢纽；体外液滴实验和FRAP验证β-catenin相分离；APEX2邻近标记质谱鉴定组分；FUS或PARP1敲除导致β-catenin凝聚体减小或H3K4me3降低，并下调枢纽基因表达。
- 研究意义
- 揭示了相分离、基因组组织与癌症进展之间的机制联系，为理解结直肠癌中癌基因协同调控提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证环枢纽的活性转录环境
环枢纽内的基因是否更高表达且受Wnt/β-catenin信号调控
分析RNA测序数据，比较环枢纽内外基因表达；用β-catenin缺失和Wnt激活剂处理，检查差异化表达基因；进行H3K4me3 HiChIP分析重叠环。
干扰环枢纽并评估功能
环枢纽对基因表达和细胞生长是否必需
用dCas9-KRAB-MeCP2系统在环枢纽区域诱导DNA甲基化，通过亚硫酸盐测序验证甲基化增加，3C-qPCR检测环强度变化，qPCR检测基因表达，CCK8和集落形成检测细胞生长。
验证β-catenin相分离凝聚体
β-catenin能否形成相分离凝聚体并与环枢纽共定位
体外纯化eGFP-β-catenin蛋白进行液滴形成实验；在HCT116和正常细胞及临床组织中用免疫荧光检测内源凝聚体；FRAP分析流动性；SunTag实验标记环枢纽并观察共定位。
鉴定β-catenin凝聚体组分
哪些蛋白质在β-catenin凝聚体中并可能参与其功能
使用dCas9-APEX2邻近标记在三个环枢纽处标记蛋白质，结合质谱鉴定组分，并通过PSPHunter和PhaSePred预测相分离能力，选择候选进行验证。
验证组分的支架或客户特性
鉴定组分中哪些是支架蛋白，哪些是客户蛋白
体外液滴实验测试候选蛋白是否独立形成液滴及与β-catenin共定位；在细胞内共表达验证共定位；通过混合β-catenin和FUS或PARP1评估对液滴形成的影响。
分析关键组分的基因组结合
β-catenin及其组分蛋白是否共同结合环枢纽区域
进行β-catenin、DHX9和FUS的ChIP-seq，分析结合位点与环枢纽的重叠，比较β-catenin特异性峰与共享峰与环枢纽基因的关联。
功能缺失验证
FUS和PARP1敲除对凝聚体、环结构和转录的影响
使用CRISPR/Cas9敲除FUS或PARP1，通过Western blot和测序验证，观察β-catenin凝聚体数量、环强度、H3K4me3水平及基因表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | ZETA | BM0003 |
| 胎牛血清 | Cas9X | FBP-C520 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| HiChIP实验 | 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11697498001 |
| MboI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| 生物素标记的dATP | -- | -- | |
| DNA聚合酶I大片段（Klenow片段） | NEB | -- | |
| T4 DNA连接酶 | NEB | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| 核糖核酸酶A | Thermo | EN0531 | |
| 蛋白酶K | Invitrogen | 25530049 | |
| Tn5转座酶 | Vazyme | TD501 | |
| 链霉亲和素T1磁珠 | Invitrogen | 65601 | |
| PCR扩增试剂盒 | Vazyme | TD202 | |
| ChIP-seq实验 | Qubit荧光计 | Thermo Fisher | -- |
| CUT&Tag实验 | Hyperactive Universal CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD904-01 |
| 蛋白酶抑制剂片剂 | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RNA-seq实验 | RNA-easy提取试剂 | Vazyme | -- |
| 亚硫酸盐测序 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| TIANGEN DNA甲基化试剂盒 | TIANGEN | DP215-02 | |
| ZymoTaq预混液 | Zymo Research | E2003-1 | |
| dCas9-APEX2邻近标记 | 过氧化氢 | -- | -- |
| 抗坏血酸钠 | Aladdin | S105024 | |
| Trolox | -- | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | 65601 | |
| NuPAGE Bis-Tris凝胶 | Thermo Scientific | NP0009 | |
| GelCode Blue蛋白染色液 | Thermo Scientific | 24594 | |
| Western blot | Cytobuster裂解液 | Millipore | 134044 |
| PVDF膜 | Bio-rad | 1620177 | |
| ECL底物 | Bio-rad | 170-5061 | |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | MCE | HY-D0814 |
| 蔡司共聚焦显微镜LSM 800 | Zeiss | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000150 |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000046 | |
| PCA25-Cas9-sgRNA-eGFP载体 | Addgene | 62988 | |
| TA克隆 | Taq DNA聚合酶 | GenStar | A002-10 |
| Hieff Clone Zero TOPO-TA克隆试剂盒 | YEASEN | 10907ES08 | |
| DH5α感受态细胞 | -- | -- | |
| DNA提取和PCR | Phanta Flash预混液 | Vazyme | P520-01 |
| RNA提取和qRT-PCR | SteadyPure通用RNA提取试剂盒 | AG | AG21017 |
| Evo M-MLV反转录试剂盒 | AG | AG11705 | |
| SYBR Green qPCR预混液 | AG | AG11701 | |
| LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 体外液滴形成 | pET28a载体 | -- | -- |
| BL21大肠杆菌 | Gensand | SEC19 | |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | Solarbio | I1020-5 | |
| 非变性裂解液 | Beyotime | P2226-2 | |
| BeyoGold His标签纯化树脂 | Beyotime | P2226-1 | |
| 聚乙二醇8000 | Sigma | 89510-250G-F | |
| 氯化钠 | Sigma | S5150-1L | |
| 离心过滤器 | Millipore | UFC903096 | |
| FRAP | 尼康A1+共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| CCK8细胞增殖 | CCK-8细胞增殖检测试剂盒 | MCE | 244902 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HiChIP | 细胞类型（HCT116）、抗体（β-catenin或H3K4me3）、限制性内切酶（MboI）、生物素标记步骤、交联条件（1%甲醛）、裂解缓冲液成分、超声参数 阅读提示：Methods - HiChIP |
| RNA-seq | 细胞样本量（5百万个细胞/次）、RNA提取试剂、差异表达基因阈值（FDR<0.01，倍数变化>2） 阅读提示：Methods - RNA-seq；Quantification and statistical analysis |
| DNA甲基化干扰 | dCas9-KRAB-MeCP2系统、sgRNA序列（靶向环枢纽1和2）、转染试剂（jetPRIME）、甲基化检测方法（亚硫酸盐测序）、环强度检测（3C-qPCR） 阅读提示：Methods - HCT116 cells carrying dCas9-KRAB-MeCP2；Results - 图3 |
| 相分离实验 | β-catenin浓度范围、盐浓度（125 mM NaCl）、10% PEG-8000、eGFP标签、蛋白质纯化方法、液滴形成缓冲液 阅读提示：Methods - In vitro droplet formation |
| 邻近标记 | dCas9-APEX2系统、sgRNA设计（每个环枢纽两个）、生物素-苯酚浓度（500 μM）、处理时间（30分钟）、H2O2浓度（1 mM）、淬灭缓冲液 阅读提示：Methods - dCas9-APEX2 MS |
| 基因敲除 | CRISPR/Cas9载体（PCA25）、sgRNA序列、转染试剂、敲除验证（Western blot、测序、TA克隆） 阅读提示：Methods - FUS or PARP1 deletion HCT116 |