样本收集与细胞分选
获得来自PsA患者和健康对照的原代CD4+和CD8+T细胞，用于多组学分析，以研究疾病相关遗传位点的调控机制。
从55名PsA患者和19名健康对照的外周血中分离PBMC，使用EasySep负选试剂盒分选CD4+和CD8+T细胞；部分患者的滑液也用透明质酸酶处理后分离细胞。
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原代T细胞多组学分析阐明疾病相关遗传位点背后的机制
Multi-omics analysis in primary T cells elucidates mechanisms behind disease-associated genetic loci
实验完整度
高包含多层级验证：大规模Hi-C、RNA-seq、ATAC-seq多组学数据，结合eQTL、caQTL、insQTL、loopQTL和等位基因不平衡分析，并通过CRISPR/Cas9功能实验验证增强子-基因调控关系。
主要模型
原代CD4+ T细胞 原代CD8+ T细胞 CD4+ T细胞系Jurkat CD8+ T细胞系MyLa
重点核对
使用Arima Hi-C试剂盒制备Hi-C文库，起始细胞量200万 Hi-C测序深度350M reads/文库，150bp双端 ATAC-seq使用Omni-ATAC协议，起始细胞量5万 CRISPR/Cas9编辑初级CD4+ T细胞，使用两个sgRNA删除约200bp区域 CD4+ T细胞激活使用CD3/CD28 Dynabeads，比例为1:1，激活时间72h
摘要
背景：全基因组关联研究(GWAS)已经揭示了许多疾病和病症背后的遗传基础。然而，这些遗传位点大多影响调控区域，使得解释具有挑战性。染色质构象在基因调控中具有基本作用，经常被用来将潜在靶基因与调控区域相关联。然而，以前的研究大多使用小样本量和永生化细胞系而非原代细胞。结果：在此，我们展示了迄今为止最大规模的来自银屑病关节炎患者和健康对照的原代CD4+和CD8+T细胞的染色质构象数据集，并匹配了基因表达和染色质可及性数据。我们生成了108个Hi-C文库（490亿个读数）、128个RNA-seq文库和126个ATAC-seq文库。这些数据增强了我们对GWAS变异影响基因调控机制的理解，以前所未有的规模揭示了遗传变异如何改变原代细胞中的染色质可及性和结构。我们完善了GWAS位点与相关调控元件（如CTCF结合位点和其他增强子元件）的映射，有助于基因分配。我们揭示BCL2L11是类风湿关节炎(RA)位点rs13396472内可能的因果基因，尽管GWAS变异相对于ACOXL位于内含子位置，并且我们确定了RA位点rs4409785中涉及SESN3失调的机制。结论：鉴于这些基因在T细胞发育和成熟中的重要作用，我们的工作加深了对自身免疫性疾病发病机制的理解，并提出了潜在的治疗靶点。此外，我们的数据集为免疫介导疾病和基因调控机制的研究提供了宝贵的资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用原代T细胞的大规模多组学数据，阐明疾病相关遗传位点（特别是GWAS位点）影响基因调控的机制？
- 核心机制
- 遗传变异通过改变染色质可及性和三维结构（如改变CTCF结合、增强子活性）影响基因表达，进而影响疾病风险。具体包括：变异影响CTCF结合导致染色质环和结构域改变；变异影响增强子活性导致靶基因表达改变。
- 主要证据
- 利用108个Hi-C、128个RNA-seq和126个ATAC-seq文库，结合eQTL、caQTL、insQTL、loopQTL和等位基因不平衡分析，并通过CRISPR/Cas9敲除增强子验证了BCL2L11的表达调控。
- 研究意义
- 研究加深了对自身免疫性疾病发病机制的理解，并提出了潜在的治疗靶点（如BCL2L11和SESN3），同时提供了一个宝贵的资源用于研究免疫介导疾病和基因调控机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Hi-C文库构建与测序
生成高分辨率染色质构象图谱，以研究基因调控相关的三维基因组结构。
取200万细胞用Arima Hi-C试剂盒制备文库，使用KAPA HyperPrep试剂盒和Illumina TruSeq双端索引，NovaSeq6000平台测序，目标深度350M reads。
RNA-seq文库构建与测序
测量基因表达水平，以关联染色质构象与基因表达。
RNA提取后由NovoGene UK构建文库（polyA富集、随机六聚体引物），NovaSeq6000测序，目标深度40M reads。
ATAC-seq文库构建与测序
测量染色质可及性，以识别调控元件（增强子、启动子）。
取5万冻存细胞用Omni-ATAC protocol构建文库，NextSeq2000测序，目标深度50M reads。
数据处理与QTL分析
识别与基因表达、染色质可及性、绝缘分数和环强度相关的遗传变异。
Hi-C数据用HiC-pro处理，loop calling用Mustache；RNA-seq用salmon定量，DESeq2差异分析；ATAC-seq用macs2回调峰，DiffBind定量；QTL分析用QTLtools，包括eQTL、caQTL、insQTL、loopQTL。
等位基因不平衡分析
在不依赖群体比较的情况下，直接检测杂合子中两个等位基因的差异信号，以精细定位因果变异。
对Hi-C和ATAC-seq数据重新比对到masked基因组，拆分等位基因特异性读数，用apeglm beta-binomial模型检测等位基因不平衡。
功能验证（CRISPR/Cas9）
验证rs13401811增强子区域对BCL2L11基因表达的调控作用。
在原代CD4+T细胞中用CRISPR/Cas9删除约200bp包含rs13401811的ATAC-seq峰区域，通过RT-qPCR检测BCL2L11表达变化。
与公共数据集整合
利用公共eQTL数据验证本研究发现的调控机制，并将结果推广到更多疾病位点。
使用eQTLgen数据验证rs4409785风险等位基因降低SESN3表达，使用DICE数据库检查ACOXL在免疫细胞中的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
染色质构象分析
功能验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | EasySep人CD4+T细胞负选试剂盒 | StemCell Technologies | 17952 |
| EasySep人CD8+T细胞负选试剂盒 | StemCell Technologies | 17953 | |
| 滑液处理 | 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3884 |
| Hi-C文库制备 | Arima Hi-C试剂盒 | Arima Genomics | -- |
| KAPA HyperPrep试剂盒 | Roche | KK8504 | |
| Hi-C/ATAC-seq文库质控 | NEBNext文库定量试剂盒（用于Illumina） | -- | E7630 |
| TapeStation 4200 | Agilent | -- | |
| RNA提取 | Qiazol裂解试剂 | QIAGEN | 79306 |
| RNeasy MinElute试剂盒 | QIAGEN | 74204 | |
| ATAC-seq文库制备 | Recovery细胞培养冻存培养基 | Thermofisher | 12648010 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | ThermoFisher | R8758 |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 白细胞介素-2 | Gibco | -- | |
| 细胞激活 | CD3/CD28磁珠 | Thermo Scientific | -- |
| CRISPR/Cas9 | Neon转染系统10 µL试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| TrueCut Cas9蛋白 | Thermo Fisher | -- | |
| DNA提取 | QIAamp DNA试剂盒 | Qiagen | -- |
| 基因分型 | Infinium HumanCoreExome 24 BeadChip试剂盒 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | BCL2L11 TaqMan探针 | Thermo Scientific | Hs00708019_s1 |
| UBC TaqMan探针 | Thermo Scientific | Hs05002522_g1 | |
| Quantstudio Flex 12 K实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞系培养 | Jurkat E6-1细胞 | -- | -- |
| MyLa细胞 | Sigma-Aldrich | 95051033 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与细胞分选 | 患者和对照的纳入标准、疾病活动度评估、外周血和滑液样本量、细胞分选试剂盒及具体操作 阅读提示：Methods: Sample collection and cell isolation |
| Hi-C文库制备 | 交联条件（甲醛浓度、时间）、细胞起始量、文库制备试剂盒、测序平台及深度 阅读提示：Methods: Hi-C library preparation and sequencing |
| RNA-seq文库制备 | RNA提取方法、文库构建协议、测序深度、比对和定量方法 阅读提示：Methods: RNA-seq library preparation and sequencing |
| ATAC-seq文库制备 | 细胞起始量、ATAC-seq协议、测序深度、peak calling和定量方法 阅读提示：Methods: ATAC-seq library preparation and sequencing |
| QTL分析 | 基因型来源、MAF过滤阈值、协变量选择、FDR校正方法 阅读提示：Methods: QTL analysis |
| 等位基因不平衡分析 | 比对策略（masked基因组）、变异检测和等位基因不平衡测试的统计模型 阅读提示：Methods: Identification of loops with allelic imbalance 和 Identification of variants with an allelic imbalance in ATAC-seq |
| CRISPR/Cas9功能验证 | CD4+ T细胞激活条件、电转参数、sgRNA序列、Cas9用量、编辑效率评估方法 阅读提示：Methods: CD4+ T-cell isolation, activation, and culture 和 Cas9 RNP knockout |