数据分析与相关性分析
探究基因组 5mC 甲基化水平与 G4 形成之间的关联
利用公共 HeLa 和 K562 细胞的 WGBS 和 G4 CUT&Tag 数据，分析 TSS 上下游各 1kb 区域的甲基化水平与 G4 信号，并比较超甲基化与低甲基化基因中的 G4 和 PQS 丰度。
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DNA 5mC 甲基化抑制基因组中 G-四链体结构的形成
DNA 5mC methylation inhibits the formation of G-quadruplex structures in the genome
实验完整度
高包含生物信息学分析、细胞模型（DNMT1敲除、抑制剂处理）、临床样本验证、体外生化实验（CD、EMSA）等多层级证据，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
人类 293T 细胞 人类 SK-Hep-1 细胞 人类 HeLa 和 K562 细胞系分析数据 结直肠癌患者组织样本 体外合成的 G4 寡核苷酸
重点核对
甲基化抑制剂处理浓度：293T 和 SK-Hep-1 细胞用 5 μM 5-aza-dC 或 150 μM RG108 处理 3 天 DNMT1 敲除细胞系：293T 细胞经 CRISPR/Cas9 敲除 DNMT1 获得 DNMT1-KO-1 和 DNMT1-KO-2 DNMT1 回补实验：DNMT1-KO-2 细胞转染 pEGFP-DNMT1 质粒（2 μg）48 小时 G4 检测方法：使用 BG4 抗体进行免疫荧光和 CUT&Tag 对照设置：使用 IgG 作为 G4 CUT&Tag 的阴性对照，使用未甲基化寡核苷酸作为 EMSA 的对照
摘要
背景：G-四链体结构（G4s）已在许多生物的基因组中被鉴定，并已被证明在基因转录中发挥重要的表观遗传调控作用。有趣的是，只有一小部分预测的 G4 形成序列能在细胞条件下折叠成 G4。在这里，我们利用公开数据、甲基化抑制剂、DNA 甲基转移酶 1（DNMT1）敲除和多种“组学”技术来研究 DNA 甲基化和染色质可及性对 G4 形成的相互作用及其对基因表达的影响。结果：我们发现基因组 5mC DNA 甲基化水平与 G4 丰度之间存在拮抗相关性。当通过甲基化抑制剂处理或 DNMT1 敲除降低全基因组甲基化水平时，基因组 G4 的丰度显著增加。DNMT1 敲除细胞中 G4 信号的增加可被 DNMT1 过表达逆转。结合 ATAC-seq、全基因组亚硫酸盐测序和 G4 CUT&Tag 分析表明，5mC DNA 甲基化在开放和关闭染色质状态下均抑制 G4 形成。5mC 修饰对 G4 形成的抑制作用通过体外圆二色谱和电泳迁移率变动分析得到验证。G4 CUT&Tag 和 RNA-seq 分析表明，DNA 甲基化减少增强 G4 形成并促进邻近基因的转录。结论：本研究表明 5mC DNA 甲基化直接抑制基因组中 G4 的形成，并调节随后的基因转录，证实了 G4 与 DNA 甲基化之间的相互作用是基因转录表观遗传调控的重要机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DNA 5mC 甲基化在基因组范围内是否影响 G4 的形成，并进而调节基因转录？
- 核心机制
- 5mC DNA 甲基化直接抑制 G4 形成，无论染色质状态如何，从而减少 G4 与 G4 结合蛋白的相互作用，最终影响基因转录。
- 主要证据
- 基于 WGBS、ATAC-seq 和 G4 CUT&Tag 分析显示甲基化与 G4 负相关；在 DNMT1 敲除细胞和甲基化抑制剂处理细胞中观察到 G4 增加；体外 CD 和 EMSA 证实 5mC 修饰直接抑制 G4 形成。
- 研究意义
- 研究揭示 DNA 甲基化通过影响 G4 形成调控基因转录的新机制，有助于理解两种表观遗传调控机制之间的关系，并可能对生物发育和人类疾病有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床样本验证
在癌症组织中验证低甲基化与高 G4 丰度的负相关关系
收集结直肠癌患者癌变和癌旁组织，通过 ELISA 检测整体甲基化水平，通过免疫荧光检测 G4 丰度。
细胞模型构建与处理
通过降低甲基化水平（抑制剂或基因敲除）观察 G4 丰度的变化
用 5-aza-dC 或 RG108 处理 293T 和 SK-Hep-1 细胞；或利用 CRISPR/Cas9 敲除 293T 细胞的 DNMT1 基因，然后通过免疫荧光检测甲基化水平和 G4 信号。
多组学分析（G4 CUT&Tag, ATAC-seq, WGBS）
解析甲基化与染色质可及性对 G4 形成的独立影响
在 293T 和 DNMT1-KO-2 细胞中进行 G4 CUT&Tag、ATAC-seq 和 WGBS 测序，比较 G4 信号、染色质可及性和甲基化水平。
转录组分析（RNA-seq）
检测 DNMT1 敲除后基因表达变化及与 G4 形成的关系
对 293T 和 DNMT1-KO-2 细胞进行 RNA-seq，鉴定差异表达基因，并分析上调基因启动子区域 G4 信号变化。
体外验证实验
验证 5mC 修饰直接抑制 PQS 折叠成 G4
合成含有或不含 5mC 修饰的 G4 序列（来自 hPDGFR-β、hVEGF、BmPOUM2），通过圆二色谱（CD）和电泳迁移率变动分析（EMSA）检测 G4 形成情况，并通过 BG4 和 LARK 结合实验进一步验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证 DNA 甲基化水平
验证 G4 形成
验证染色质可及性
转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | Thermo Scientific | 11995065 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | 10099141 | |
| 青霉素和链霉素 | Thermo Scientific | 15140122 | |
| 药物处理 | 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 | Sigma | A3656 |
| RG108 | MedChemExpress | HY-13642 | |
| 吡啶并他汀 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | BG4-Flag 抗体 | Merck | MABE917 |
| 兔抗 Flag 抗体 | Cell Signaling Technology | 2368 | |
| Alexa Fluor 594 标记的二抗 | Thermo Fisher | A11037 | |
| DAPI | -- | -- | |
| ProLong Diamond 抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P36970 | |
| 抗 5mC 抗体 | Active Motif | 39649 | |
| Alexa Fluor 488 二抗 | Thermo Fisher | A11029 | |
| 奥林巴斯 FV1000 共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| DNMT1 敲除 | PX459 载体 | Addgene | 104142 |
| 细胞转染 | FuGENE HD 转染试剂 | Promega | E2311 |
| qRT-PCR | Eastep 超总 RNA 提取试剂盒 | Promega | LS1040 |
| GoScript 逆转录混合液和随机引物 | Promega | A2800 | |
| Western blot | RIPA 裂解液 | -- | -- |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 抗 DNMT1 抗体 | Abcam | ab188453 | |
| 抗 His 标签抗体 | Abcam | ab9108 | |
| 抗 GAPDH 抗体 | Abcam | ab9485 | |
| 细胞转染 | Opti-MEM 减血清培养基 | Thermo Fisher | 31985070 |
| 冷冻切片 | Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek-USA | -- |
| 徕卡 CM1950 冰冻切片机 | Leica Biosystems | -- | |
| BSP 分析 | 甲基化检测试剂盒 | Active Motif | 55001 |
| CUT&Tag | 通用 CUT&Tag 检测试剂盒 | Vazyme | TD903 |
| FLAG 标记的 BG4 | Merck | MABE917 | |
| 兔抗 FLAG 抗体 | CST | 14793 | |
| VAHTS DNA 纯化磁珠 | Vazyme | N411 | |
| 细胞计数仪 | Nexcelom Bioscience | -- | |
| ATAC-seq | 高灵敏度开放染色质谱分析试剂盒 2.0 | Novoprotein | N248 |
| NovoNGS DNA 纯化磁珠 | Novoprotein | N240 | |
| WGBS | 细胞培养 DNA 中量提取试剂盒 | Qiagen | 13343 |
| Zymo EZ DNA 甲基化金试剂盒 | Zymo | D5005 | |
| JumpStart Taq DNA 聚合酶 | Sigma | D4184-50UN |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和药物处理 | 细胞系（293T, SK-Hep-1）来源和培养条件（DMEM、10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、37°C、5% CO2）；药物处理浓度和时间（5 μM 5-aza-dC 或 150 μM RG108 处理 3 天，每 24 h 换液）；PDS 处理浓度和时间（10 μM 处理 48 h） 阅读提示：Methods: Cell culture, chemical treatment, and clinical samples |
| 免疫荧光检测 | 细胞固定（4% 多聚甲醛，10 分钟）、通透（0.2% Triton X-100，10 分钟）、封闭（5% BSA 和 5% 山羊血清，1 小时）；BG4-Flag 抗体稀释度（1:100）和孵育时间（37°C 1 小时）；抗 Flag 二抗稀释度（1:800）和孵育时间；荧光二抗稀释度（1:500）和孵育时间；封片剂；图像采集参数（共聚焦显微镜 pinhole 0.6 Airy units） 阅读提示：Methods: Immunofluorescence staining |
| DNMT1 敲除 | sgRNA 靶向序列和设计工具；PX459 载体构建和转染方法（FuGENE HD）；筛选浓度和时间（嘌呤霉素）；克隆筛选方法（有限稀释至 96 孔板）；基因型验证（PCR 和测序） 阅读提示：Methods: DNMT1 knockout in cells |
| DNMT1 回补实验 | 质粒（pEGFP-DNMT1 和 pEGFP 对照）和剂量（2 μg）；转染试剂（FuGENE HD）和比例（DNA:试剂 = 1:3）；转染时间（48 h） 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| 体外 CD 和 EMSA | 寡核苷酸序列和 5mC 修饰位点；寡核苷酸浓度（5 μM CD, 2 μM EMSA）；缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM KCl）；退火条件（95°C 10 分钟，缓慢冷却至室温）；蛋白用量（2 μg LARK 或 1 μg BG4） 阅读提示：Methods: Circular dichroism (CD) and Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) |
| 多组学测序（CUT&Tag, ATAC-seq, WGBS, RNA-seq） | 细胞数量（CUT&Tag: 1×10^6；ATAC-seq: 5×10^4）；抗体稀释度（BG4 1:50）；测序平台（Illumina NovaSeq 或 NovaSeq 6000）；生物学重复数量（3 个）；参考基因组（hg38）；比对软件（Bowtie2, BSMAP, HISAT2）；峰值 calling 和差异分析软件（MACS2, DESeq） 阅读提示：Methods: CUT&Tag, ATAC-seq, WGBS, RNA-seq processing and analysis |
| 临床样本分析 | 患者信息和伦理批准；样本类型（癌变和癌旁直肠组织）；ELISA 和免疫荧光检测方法（抗体、浓度） 阅读提示：Methods: Cell culture, chemical treatment, and clinical samples; Immunofluorescence staining |