临床遗传学鉴定
鉴定三个个体中的反复从头MAX p.Arg60Gln变异
通过DDD和Nijmegen队列的外显子组测序发现三个个体携带相同的c.179G>A变异，并通过Sanger测序验证。
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反复出现的从头MAX p.Arg60Gln变异通过c-Myc靶基因的差异表达导致综合征性过度生长疾病
A recurrent de novo MAX p.Arg60Gln variant causes a syndromic overgrowth disorder through differential expression of c-Myc target genes
实验完整度
高包含多个证据层级：临床遗传分析、细胞系过表达功能验证、生物物理分析（CD、EMSA）、转录组测序及机制验证。
主要模型
HEK293细胞 患者外周血RNA 纯化的b-HLH-LZ结构域（Max∗） c-Myc∗:Max∗异二聚体
重点核对
MAX p.Arg60Gln变异（c.179G>A）的鉴定与Sanger验证 HEK293细胞中MAXArg60Gln过表达后CCND2 mRNA和蛋白水平的变化 Max∗Arg60Gln与c-Myc∗异二聚化效率及E-box结合亲和力 RNA-seq中c-Myc靶基因的差异表达 Omomyc-CPP对c-Myc转录活性抑制的潜在治疗作用
摘要
细胞周期蛋白D2（CCND2）的稳定化通过CCND2的突变或编码PI3K-AKT通路成分的上游基因的激活突变，支撑一系列巨头症相关疾病。在这里，我们描述了三个携带相同反复出现的从头c.179G>A（p.Arg60Gln）变异在Myc相关因子X（MAX）中的个体，其表型与巨头症相关重叠。该突变位于b-HLH-LZ结构域，通过增加转录导致细胞内CCND2增加，但并未导致CCND2的稳定化。我们表明，纯化的MAXArg60Gln（Max∗Arg60Gln）的b-HLH-LZ结构域以其靶E-box序列结合的表观亲和力较低。这导致与c-Myc更有效的异二聚化，从而在携带此突变的个体中增加c-Myc的转录活性。近期开发的Omomyc-CPP，一种细胞穿透性b-HLH-LZ结构域c-Myc抑制剂，为MAXArg60Gln个体以及其他携带类似种系突变导致c-Myc转录活性失调的个体提供了一种可能的治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MAX基因的反复从头p.Arg60Gln变异是否导致综合征性过度生长疾病？
- 核心机制
- MAXArg60Gln变异降低其同二聚体对E-box的亲和力，促进与c-Myc形成异二聚体，增强c-Myc的转录活性，导致c-Myc靶基因（如CCND2）的表达失调。
- 主要证据
- 三个携带相同变异的个体表现出巨头症和多指畸形；HEK293细胞过表达实验显示CCND2蛋白和mRNA增加，但无蛋白稳定化；生物物理分析表明Max∗Arg60Gln与c-Myc异二聚化更高效，DNA结合亲和力降低；RNA-seq显示c-Myc靶基因广泛差异表达。
- 研究意义
- 该研究首次将MAX种系突变与过度生长综合征关联，并提示c-Myc抑制剂如Omomyc可能为携带此类突变的个体提供治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞模型建立
研究MAXArg60Gln对CCND2表达的影响
在HEK293细胞中转染MAXWT或MAXArg60Gln质粒，检测CCND2蛋白和mRNA水平。
蛋白稳定性测定
检测CCND2是否因稳定化而增加
使用环己酰亚胺处理细胞，通过Western blot检测CCND2降解速率。
转录水平检测
验证CCND2表达增加是由于转录上调
通过RT-qPCR检测转染细胞和患者P1外周血RNA中CCND2 mRNA水平。
生物物理表征
评估Max∗Arg60Gln的结构、稳定性和E-box结合亲和力
通过圆二色谱和EMSA分析纯化的Max∗WT和Max∗Arg60Gln的α螺旋含量、热稳定性、与c-Myc的异二聚化效率及DNA结合亲和力。
转录组分析
全面分析MAXArg60Gln对c-Myc靶基因转录的影响
对转染MAXWT或MAXArg60Gln的HEK293细胞进行RNA-seq，并进行差异表达和通路富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 载体构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | -- |
| Gateway克隆系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Western blot | BigDye终止子试剂盒v3.1 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Bolt western blot系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| SuperSignal West Femto化学发光底物 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Bio-Rad Chemi-Doc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Restore Western blot剥离缓冲液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 细胞周期蛋白D2抗体 | Cell Signaling Technology | 3741 | |
| CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | 12790 | |
| MAX抗体 | Cell Signaling Technology | 4739 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Ambion | -- | |
| 磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(Ser807/811) XP抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 | |
| RB抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| 山羊抗兔HRP | -- | 7074 | |
| 马抗小鼠HRP | -- | 7076 | |
| Cycloheximide assay | 聚乙烯亚胺 (Merck) | Merck | -- |
| Opti-Mem减血清培养基 | -- | -- | |
| 细胞裂解 | NP-40裂解缓冲液 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（无EDTA） | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | DC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| RNA提取 | Monarch总RNA小提试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| cDNA合成 | ProtoScript第一链cDNA合成试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| RT-qPCR | TaqMAN检测系统 | ThermoFisher Scientific | -- |
| TaqMAN快速高级预混液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| CCND2探针 | -- | Hs00153380_m1 | |
| GAPDH探针 | -- | Hs99999905_m1 | |
| QuantStudio 5实时PCR系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 蛋白质表达与纯化 | 三（2-羧乙基）膦 | -- | -- |
| EMSA | 异硫氰酸荧光素标记探针 | Integrated DNA Technologies | -- |
| Molecular Imager VersaDoc MP4000系统 | Bio-Rad | -- | |
| CD光谱 | Jasco J-810旋光光谱仪 | Jasco | -- |
| RNA-seq | Illumina TruSeq文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| NextSeq 500 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本获取 | 三个个体来自两个独立队列（DDD和Nijmegen），需确认队列信息和伦理审批。 阅读提示：Subjects and methods: Clinical ascertainment and genetic analysis |
| 细胞培养与转染 | HEK293细胞培养条件（DMEM、10% FCS、37°C、5% CO2）；转染使用PEI与质粒比例为1:3；转染后24小时。 阅读提示：Cell culture and MAX vector generation; Cycloheximide assay |
| 蛋白稳定性检测 | 环己酰亚胺浓度10 μg/mL，处理时间1.5小时。 阅读提示：Cycloheximide assay |
| mRNA水平检测 | RT-qPCR使用TaqMAN系统，探针Hs00153380_m1（CCND2）和Hs99999905_m1（GAPDH），ΔΔCT方法，三个生物学重复。 阅读提示：Real-time quantitative PCR |
| 蛋白质纯化 | Max∗WT和Max∗Arg60Gln表达纯化参考Maltais等；c-Myc∗表达纯化参考Delattre等。 阅读提示：Protein expression and purification |
| EMSA | 蛋白浓度：Max∗ 500 nM，c-Myc∗ 250 nM，DNA探针250 nM；非特异DNA浓度0-2000 nM。 阅读提示：EMSA |
| 圆二色谱 | 蛋白浓度15 μM；DNA浓度10 μM（摩尔比）；温度扫描范围5-95°C，加热速率1°C/min。 阅读提示：Circular dichroism |
| RNA-seq | 起始mRNA 100 ng；Illumina TruSeq文库制备；NextSeq 500 15 bp paired-end；比对到GRCh38；DGE用DESeq2。 阅读提示：mRNA sequencing |