验证KAT抑制诱导ISG表达
确认p300/CREBBP催化抑制在AML细胞中诱导ISG表达的现象。
使用scRNA-seq和定量蛋白质组学分析MOLM-13和OCI-AML3细胞经KATi或DMSO处理24小时后的ISG表达变化；在14种AML细胞系中检测CXCL10表达；使用独立KAT抑制剂CPI-1612进行验证。
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抑制p300/CREBBP催化活性在急性髓系白血病中驱动依赖于环境限制的转录激活
Inhibition of p300/CREBBP catalytic activity drives context-dependent transcriptional activation in AML
实验完整度
高包含体外细胞系功能实验、多组学分析（scRNA-seq、SLAM-seq、PRO-seq、ChIP-seq、蛋白质组学）以及体内异种移植和小鼠模型验证，并进行了CRISPR筛选和Perturb-seq机制验证。
主要模型
MOLM-13细胞系（KMT2A重排AML） OCI-AML3细胞系（NPM1突变AML） MOLM-13异种移植NSG小鼠模型 Npm1c/Flt3-ITD突变驱动的C57BL/6小鼠AML模型
重点核对
KAT抑制剂处理浓度和时间（如A-485 1000 nM，24小时） STAT1敲低对ISG诱导和细胞活力的影响 BRDi和Deg作为对照处理对p300/CREBBP功能的影响 IFNa（10 ng/mL）与KATi（500 nM）联合处理的协同效应 体内模型中KATi（100 mg/kg）和IFNa（1×10^6 U/kg）的给药方案
摘要
赖氨酸乙酰转移酶（KAT）EP300赖氨酸乙酰转移酶（p300）/CREB结合蛋白（CREBBP）的活性传统上与转录激活相关。这主要归因于组蛋白残基的乙酰化，如组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac），这是活性调控元件的标志性特征。在这里，我们发现在急性髓系白血病（AML）中，抑制p300/CREBBP催化可矛盾地增加转录。我们将新生和总转录的时间分辨动态与p300/CREBBP及其相关转录因子（TF）/共调节因子（通过染色质下拉蛋白质组学、乙酰化蛋白质组学和基序富集推测）的染色质结合动态相结合，以揭示p300/CREBBP催化抑制后转录重连的机制。同时，我们使用全基因组CRISPR-Cas9 dropout和聚焦的Perturb-seq筛选，剖析了单个p300/CREBBP乙酰化相互作用组成员对KAT抑制的功能贡献。总之，这些方法揭示了KAT抑制矛盾地保留p300/CREBBP，并在一个子集的调控元件上促进协同TF组装和增加的H3K27乙酰化。这种效应在干扰素调节因子（IRF）基序富集的基因座（包括干扰素刺激基因（ISG））中最为明显，其中KAT抑制触发p300/CREBBP积累并增强组合TF结合，使得ISG激活剂STAT1的招募成为可能。因此，ISG位点被转换为转录活跃状态，诱导细胞周期停滞、分化和凋亡。在治疗上，KAT抑制与干扰素-α联合增强ISG表达，协同驱动AML细胞死亡在体外，并显著延长AML异种移植模型和小鼠模型的生存期。这些发现完善了我们对p300/CREBBP KAT活性的理解，表明协同TF组装可以在催化抑制下重新配置p300/CREBBP复合物以诱导转录，对通过催化抑制重编程干扰素驱动的程序在AML及其他疾病中具有转化意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- p300/CREBBP催化活性抑制在AML中如何矛盾地激活转录，特别是干扰素刺激基因（ISG）的表达？
- 核心机制
- KAT抑制导致p300/CREBBP保留在染色质上，促进协同转录因子组装，特别是IRF基序富集的区域，增加H3K27ac和STAT1招募，从而激活ISG转录。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq、SLAM-seq、PRO-seq、ChIP-seq和蛋白质组学分析显示KAT抑制导致p300/CREBBP在IRF/ISG位点积累，H3K27ac增加以及STAT1结合；功能实验包括CRISPR筛选和STAT1敲低证实其参与。
- 研究意义
- 该发现挑战了p300/CREBBP KAT活性仅促进转录的传统观点，并为联合KAT抑制和IFNa治疗AML提供理论基础，可能扩展到其他对干扰素反应有益的疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估STAT1在ISG诱导中的作用
确定STAT1是否为KAT抑制诱导ISG表达的关键介质。
通过诱导性shRNA敲低STAT1，检测对CXCL10表达和细胞活力的影响。
比较KATi、BRDi和Deg对转录的影响
区分催化抑制与支架/信号整合功能对ISG诱导的作用。
使用SLAM-seq分析新生和总RNA的动态变化；分别用KATi、BRDi和Deg处理，并分析ISG表达和基因集富集。
分析p300/CREBBP结合动态
研究KAT抑制对p300/CREBBP染色质结合的影响。
通过RIME、SILAC乙酰化蛋白质组学和ChIP-seq分析p300/CREBBP及其相互作用网络；进行基序富集和GO分析。
鉴定协同转录因子组装
探究KAT抑制后哪些转录因子和共调节因子在IRF/ISG位点组装。
通过PRO-seq和ChIP-seq分析转录变化和因子结合，比较增加和减少转录的区域，并进行基序分析。
功能筛选乙酰相互作用组成员
确定p300/CREBBP乙酰相互作用组成员在KATi诱导的ISG表达和细胞毒性中的作用。
进行全基因组CRISPR-Cas9 dropout筛选和聚焦Perturb-seq，分析基因敲除对ISG表达和细胞活力的影响。
验证STAT1招募和机制
确认KAT抑制促进STAT1在IRF/ISG位点的从头招募。
通过ChIP-seq和ChIP-qPCR检测STAT1结合，并进行western blot检测总STAT1和磷酸化STAT1水平。
体外评估KATi与IFNa联合效果
评估KATi与IFNa联合对ISG表达和凋亡的协同作用。
使用KATi（A-485或CPI-1612）和IFNa处理AML细胞，检测CXCL10表达和凋亡。
体内验证疗效
评估KATi与IFNa联合在AML小鼠模型中的治疗效果。
MOLM-13异种移植NSG小鼠和Npm1c/Flt3-ITD小鼠模型，给予vehicle、IFNa、KATi或联合治疗，监测生存期和白血病浸润。
在患者样本中验证
测试KATi与IFNa联合在AML和CMML原代细胞中的效果。
处理原代单核细胞，检测ISG表达、细胞活力和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| StemSpan SFEMII培养基 | StemCell Technologies | -- | |
| CD34+扩增添加物（UM729, SR1） | -- | -- | |
| 药物处理 | A-485 | -- | -- |
| CPI-1612 | -- | -- | |
| (S,S)-CPI-1612 | -- | -- | |
| inobrodib | -- | -- | |
| p300/CREBBP的PROTAC降解剂 | -- | -- | |
| 干扰素α | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo试剂盒 | Promega | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V / 7-AAD染料 | -- | -- |
| RT-qPCR | SYBR Green | -- | -- |
| 蛋白质印迹 | 抗STAT1抗体 | -- | -- |
| 抗磷酸化STAT1抗体 | -- | -- | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | -- | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | 抗p300抗体 | -- | -- |
| 抗CREBBP抗体 | -- | -- | |
| 抗ARID1A抗体 | -- | -- | |
| 抗H3K27ac抗体 | -- | -- | |
| 抗H3K27me3抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞培养基和添加物（如RPMI-1640、FBS）、人原代细胞培养条件（StemSpan SFEMII + CD34+扩增添加物） 阅读提示：Methods: Primary samples; Cell culture（如有补充） |
| 药物处理 | KATi（A-485）和CPI-1612的浓度和处理时间，以及对照化合物（如(S,S)-CPI-1612、BRDi、Deg）的浓度 阅读提示：Methods: 相关抑制剂描述及图注 |
| 基因表达检测 | RNA提取、RT-qPCR条件和内参基因（如GAPDH） 阅读提示：见图1和图例的qPCR方法 |
| 蛋白质检测 | Western blot的抗体和稀释比例 阅读提示：见图5和相关图注，补充方法 |
| 染色质免疫沉淀 | ChIP-seq和ChIP-qPCR的细胞数量、抗体、片段化条件 阅读提示：Methods: 补充方法中的ChIP步骤 |
| 流式分析 | 凋亡和细胞周期检测的染色步骤和仪器设置 阅读提示：Methods: 图6图注 |
| 体内模型 | 小鼠品系、年龄、照射剂量、细胞注射数量和途径、治疗开始时间、给药方案 阅读提示：Methods: In vivo studies; 图7图注 |