aPD1-IL18mut的分子构建与表征
生成并验证免疫偶联物的结构与功能
通过化学偶联生成aPD1-IL18mut，并通过ELISA、FcRn结合、IL-18BP抑制等实验验证其结合和功能
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抗PD-1-IL18免疫偶联物促进效应T细胞介导的抗肿瘤免疫
Anti-PD1-IL18 immunoconjugate promotes effector T cell-mediated antitumor immunity
实验完整度
高包含体外分子与细胞实验、两种小鼠肿瘤模型、人类肿瘤样本培养及单细胞转录组分析等多个独立证据层级，且包含功能验证（如细胞耗竭）和机制验证。
主要模型
MC38结肠癌小鼠模型 YUMM1.7黑色素瘤小鼠模型 B16F10黑色素瘤小鼠模型 人卵巢癌转移灶消化物共培养体系
重点核对
aPD1-IL18mut的给药剂量、途径和时间（MC38静脉注射0.25 mg/kg等） 细胞耗竭抗体的类型、剂量（10 mg/kg）和给药时间 人类肿瘤样本的供体数量及刺激条件（IL-12浓度、化合物浓度200 nM、培养时间48小时） 人PD-1转基因小鼠品系及肿瘤细胞接种数量
摘要
背景：免疫检查点抑制剂已经革新了癌症治疗，然而相当比例的患者表现出原发性或获得性耐药。免疫细胞因子通过选择性地将细胞因子信号递送至肿瘤微环境，提供了一种增强抗肿瘤免疫的策略。在此，我们描述了免疫偶联物抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）-白细胞介素（IL）-18（aPD1-IL18mut），旨在将PD-1阻断与局部IL-18介导的免疫激活相结合。方法：aPD1-IL18mut是通过将抗人PD-1抗体Lipustobart与一种经过工程改造以逃避IL-18结合蛋白的IL-18变体化学偶联而生成的。其作用机制在人PD-1转基因小鼠模型中进行了表征。为了评估这些体内发现的转化相关性，在人类肿瘤样本上进行了补充的体外测定，同时分析了公开可用的单细胞RNA测序数据集。结果：在体外，PD-1结合增强了功能性IL-18活性，即使在IL-18BP压力下也保留了干扰素（IFN）-γ分泌。在MC38肿瘤中，aPD1-IL18mut诱导了强大的CD8+ T细胞驱动的肿瘤控制，伴随着肿瘤内活化CD8+ T细胞的积累和明显的1型相关细胞因子反应。在抗PD-1耐药的YUMM1.7肿瘤中，治疗效果反而主要依赖于Th1样CD4+效应T细胞，并且aPD1-IL18mut刺激与PD-1+IL-18Rα+ CD4+ T细胞中活化、增殖、IFN-γ和颗粒酶B表达的增强相关。在人类癌症消化物培养中，aPD1-IL18mut引发了以IL-18/IFN-γ为主导的细胞因子特征，并增强了肿瘤细胞杀伤。重要的是，对多种人类实体瘤类型中免疫浸润的分析，识别出了类似的PD-1+IL-18Rα+ CD4+ Th1样和CD8+效应样T细胞亚群，这些亚群具有效应相关和肿瘤反应性的转录及蛋白质特征。结论：aPD1-IL18mut激活具有肿瘤反应性特征的T细胞群体，并在不同的肿瘤免疫环境中促进IFN-γ驱动的炎症。其激活CD8+和CD4+ Th1样效应细胞的能力，加上多种人类癌症中存在类似亚群，为PD-1靶向IL-18治疗提供了机制和转化支持。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过将IL-18靶向递送至PD-1+细胞来增强抗肿瘤免疫，并克服IL-18BP介导的抑制？
- 核心机制
- aPD1-IL18mut通过PD-1依赖的顺式递送增强IL-18信号，激活PD-1+IL-18Rα+ T细胞亚群，促进IFN-γ驱动的效应T细胞反应
- 主要证据
- 在MC38模型中CD8+ T细胞驱动肿瘤控制，在YUMM1.7模型中CD4+ Th1样细胞驱动，人类TIL共培养增强杀伤且单细胞数据表明靶细胞亚群富集
- 研究意义
- 为PD-1靶向IL-18治疗提供机制和转化支持，可能改善免疫检查点抑制剂耐药
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证
评估PD-1共结合对IL-18效力和IL-18BP耐受性的影响
使用NK92细胞、PBMC和报告细胞系，检测IFN-γ分泌、PD-1/PD-L1阻断和受体占据
MC38肿瘤模型体内疗效与机制
评估aPD1-IL18mut在免疫检查点敏感模型中的抗肿瘤活性和作用机制
在hPD-1转基因小鼠中皮下接种MC38，治疗并评估肿瘤生长、生存、免疫细胞浸润、细胞因子水平及耗竭实验
YUMM1.7肿瘤模型体内疗效与机制
评估aPD1-IL18mut在抗PD-1耐药模型中的疗效及CD4+ T细胞依赖性
在hPD-1小鼠中皮下接种YUMM1.7，腹腔注射治疗，进行耗竭实验和表型分析
人肿瘤样本体外验证
评估aPD1-IL18mut对人肿瘤浸润淋巴细胞活性和肿瘤杀伤的影响
使用人卵巢癌转移灶消化物，进行Olink细胞因子分析、共培养杀伤实验和IFN-γ检测
转录组数据分析
表征多种癌症中PD-1+IL-18Rα+ T细胞的转录组特征
分析公开的单细胞RNA测序数据集，进行基因集富集分析，验证靶细胞亚群的存在和特征
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子构建 | Lipustobart | -- | -- |
| IL-18突变体 | -- | -- | |
| ELISA | 生物素化人PD-1-Fc | BioLegend | 789406 |
| 重组人FcγRI/CD64蛋白 | R&D systems | 1257-FC-050, CF | |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Sigma | RABHRP3 | |
| 抗His标签HRP偶联抗体 | R&D systems | MAB050H | |
| TMB底物 | Sigma | CL07 | |
| FcRn结合检测 | AlphaLISA人FcRn结合试剂盒 | Revvity | AL3095C |
| IL-18BP结合检测 | IL-18BP ɑLISA试剂盒 | Revvity | -- |
| His标签IL-18BP | SinoBiologicals | 10357-H08H | |
| PBMC刺激 | Histopaque-1077 | Sigma | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 重组人IL-12 | Sino Biological | CT011-H08H | |
| LEGENDplex试剂盒 | BioLegend | 740930 | |
| PD-1/PD-L1阻断实验 | Jurkat-Lucia TCR-hPD-1细胞 | InvivoGen | -- |
| QUANTI-Luc | InvivoGen | -- | |
| Enspire酶标仪 | Perkin Elmer | -- | |
| NK92细胞培养 | NK92细胞 | ATCC | -- |
| α-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | -- | |
| IL-2 | PeproTech | -- | |
| NK92细胞转导 | 慢病毒表达载体 | Biocat | VB210226-1046xyn, LPP-B0169-Lv156-200 |
| NK92细胞IFN-γ释放 | 人IFN-γ ɑLISA检测试剂盒 | Perkin Elmer | AL217C |
| OptiPlate微孔板 | Perkin Elmer | 6007270 | |
| NK92细胞转信号实验 | CFSE | Invitrogen | C34554 |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34572 | |
| TPF固定/透化缓冲液 | BD | 563239 | |
| Perm Buffer III | BD | -- | |
| 流式检测 | BV421抗NF-κB p65抗体 | BD | 565446 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 热灭活胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 热灭活马血清 | Gibco | -- | |
| 小鼠模型 | 人PD-1敲入转基因小鼠 | GemPharmatech Biotechnology | T003095 |
| 肿瘤模型 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| MC38细胞 | -- | -- | |
| YUMM1.7细胞 | -- | -- | |
| B16F10细胞 | -- | -- | |
| OVCAR3细胞 | ATCC | CVCL_0465 | |
| 抗CD4抗体 | Bio X Cell | clone GK1.5 | |
| 抗CD8抗体 | Bio X Cell | clone 2.43 | |
| 抗NK1.1抗体 | Bio X Cell | clone PK136 | |
| 大鼠IgG2b同型对照抗体 | Bio X Cell | clone LTF-2 | |
| 器官处理 | gentleMACS C管 | Miltenyi Biotec | -- |
| IV型胶原酶 | Worthington | -- | |
| Accutase | PAA | -- | |
| 透明质酸酶 | Sigma | -- | |
| IV型DNA酶 | -- | -- | |
| gentleMACS组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 血液处理 | 红细胞裂解液 | Invitrogen | -- |
| Microvette 200 EDTA K3E采血管 | Sarstedt | -- | |
| PK分析 | 抗IL-18抗体 | R&D | D044-3 |
| 生物素化小鼠抗人IgG Fc二抗 | Novus Biologics | NB110-8347, clone 3D3cc | |
| 细胞因子检测 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A65453 |
| 小鼠ProcartaPlex Mix&Match 5-plex | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| LEGENDplex（13-plex，小鼠抗病毒反应panel） | BioLegend | 740621 | |
| 人肿瘤样本处理 | Accutase | PAA Laboratories | -- |
| I型DNA酶 | Sigma | -- | |
| 流式细胞术 | Zombie UV染料 | BioLegend | -- |
| Fc受体结合抑制剂 | Bio X Cell / Invitrogen | -- | |
| Brilliant染色缓冲液 | BD Horizon | -- | |
| Foxp3/转录因子试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 抗PD-1抗体（D7D5W, D4W2J） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗兔IgG二抗 | BioLegend | -- | |
| Aurora流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| 人TIL培养 | Olink Target 48细胞因子panel | Olink Proteomics | -- |
| 重组人IL-12 | PeproTech | 200-12 | |
| IFN-γ ELISA | BD | 555142 | |
| MTT实验 | Sigma | -- | |
| 单细胞数据分析 | R | -- | -- |
| Seurat | -- | -- | |
| GraphPad Prism | -- | V.10.4.2 | |
| 统计分析 | FlowJo | -- | V.10.10.0 |
| BioRender | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MC38肿瘤模型 | MC38细胞接种数量、治疗时间、给药途径（静脉注射）和剂量 阅读提示：Methods: Tumor models and treatments; Figure 2A |
| YUMM1.7肿瘤模型 | YUMM1.7细胞接种数量、治疗时间、给药途径（腹腔注射）和剂量 阅读提示：Methods: Tumor models and treatments; Figure 3A |
| 细胞耗竭实验 | 耗竭抗体类型、剂量（10 mg/kg）、给药时间 阅读提示：Methods: Tumor models and treatments |
| 人TIL培养 | 供体数量、刺激条件（IL-12浓度、化合物浓度、培养时间） 阅读提示：Methods: Quantitative soluble biomarker assessment of human TIL cultures; Figure 4 |
| PD-1+IL-18Rα+ T细胞分析 | 数据集来源、分析流程、基因集富集分析的具体参数 阅读提示：Methods: Single-cell RNA sequencing analysis; Results section 'Transcriptomic and protein-level characterization' |