构建DD-POI-EYFP细胞模型
评估基于去稳定域的策略能否用于开发配体筛选平台。
构建表达FKBP12或CypA不稳定突变与EYFP融合蛋白的NIH3T3细胞系，并用已知配体处理验证稳定性增强。
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利用细胞蛋白稳定性增强分析在活细胞中进行高通量配体发现
High-throughput ligand discovery in living cells using the cellular protein stability enhancement assay
实验完整度
高包含基于细胞的高通量筛选模型、配体结合验证（MST、CETSA）、功能验证及计算预测和实验鉴定不稳定突变等多层级证据。
主要模型
NIH3T3细胞表达FKBP12/EIFP融合蛋白 NIH3T3细胞表达KRASG12X-EYFP融合蛋白 HEK293T细胞 A549细胞
重点核对
FKBP12不稳定突变V24A/F36V KRASG12C不稳定突变D119G/F156I 化合物处理浓度（5μmol/L）和时间（24h） 流式细胞仪分选和EYFP荧光检测 配体结合验证方法（MST、CETSA）
摘要
基于靶标的药物筛选通常依赖生化或亲和力分析，以鉴定在体外与纯化靶蛋白结合或调节其活性的化合物。然而，细胞层面的验证对于确认真实的药物-靶标相互作用至关重要。将筛选和验证整合在单一的细胞分析中可大幅加速药物发现进程。在此，我们开发了一种名为CPSEA（细胞蛋白稳定性增强分析）的细胞配体发现方法，该方法利用配体诱导含有致不稳定突变靶蛋白稳定的生物物理原理。利用CPSEA，我们分别鉴定了青蒿素B和秋水仙碱作为FKBP12和KRASG12S的新型配体。重要的是，我们引入了实验和计算策略来鉴定致不稳定突变，从而拓宽了CPSEA对有无已知稳定配体的靶蛋白的适用性。总之，CPSEA是一种强大的基于细胞的筛选策略，在基于靶标的药物发现中具有巨大潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种可在活细胞中同时进行配体筛选和靶标结合验证的高通量方法？
- 核心机制
- 配体诱导含不稳定突变的靶蛋白稳定，从而增强融合荧光蛋白信号。
- 主要证据
- 利用CPSEA筛选化合物库，结合MST、CETSA等实验验证了青蒿素B和秋水仙碱分别与FKBP12和KRASG12S结合。
- 研究意义
- CPSEA可加速靶向药物发现，为PROTAC开发和靶向蛋白降解提供起点，且秋水仙碱可能被重新用作靶向KRAS突变的先导化合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高通量配体筛选
利用DD-FKBP12和DD-KRASG12C模型筛选化合物库，以发现新的配体。
将表达DD-POI-EYFP的细胞接种于96孔板，用化合物库处理，通过高内涵流式细胞术检测EYFP荧光强度。
鉴定的去稳定突变
开发一种高效的鉴定蛋白去稳定突变的方法，以扩大CPSEA的应用范围。
通过错误倾向PCR构建突变文库，结合流式分选和深度测序鉴定配体诱导稳定的突变。
配体验证机制
验证新鉴定配体与靶蛋白的直接结合及功能效果。
使用MST、CETSA、分子对接和Western blotting等方法验证配体-靶蛋白结合及下游信号通路影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10,091-148 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15,140,122 | |
| 质粒构建 | PrimeSTAR Max DNA聚合酶 | TAKARA | R045 |
| Gibson组装试剂盒 | Vazyme | C112 | |
| 蛋白表达与纯化 | 镍离子亲和层析 | -- | -- |
| Superdex 200 凝胶过滤色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 蛋白文库构建 | GeneMorph II 随机突变试剂盒 | Agilent | 200550 |
| Endura电转感受态细胞 | Lucigen | 60242 | |
| HiSpeed质粒中提试剂盒 | Qiagen | 12643 | |
| 慢病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013D |
| 蛋白酶抑制剂 | Bimake | B14002 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1082 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Bioss | C05-02001 | |
| PAGE凝胶 | Yeasen | 20325ES62 | |
| 硝酸纤维素膜 | Pall | 66485 | |
| 蛋白降解抑制分析 | SUC-LLVY-AMC荧光底物 | Yuanye | S23031 |
| MST分析 | 蛋白标记试剂盒RED-NHS第二代 | NanoTemper | -- |
| 流式分析 | BD Accuri C6 Plus流式细胞仪 | BD | -- |
| 流式分选 | BD FACSAria III流式分选仪 | BD | -- |
| 深度测序 | 基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN Biotech | DP304-02 |
| PCR预混液 | Roche | 09420398001 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63882 | |
| NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 高通量筛选 | 96孔圆底板 | Thermo Scientific | 163,320 |
| Explorer G3高通量药物筛选系统 | PerkinElmer | -- | |
| Intellicyt iQue3流式细胞仪 | Sartorius | -- | |
| 流式分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 细胞热位移分析 | Bio-Rad C1000热循环仪 | Bio-Rad | -- |
| 热位移分析 | SYPRO Orange染料 | -- | -- |
| 圆二色光谱 | 圆二色光谱仪 | -- | -- |
| 分子对接 | AutoDock Vina | -- | -- |
| 药物处理 | 他克莫司 | TargetMol | T2144 |
| 索托拉西布 | TargetMol | T8684 | |
| 秋水仙碱 | TargetMol | T0320 | |
| MG132 | MCE | HY-13259 | |
| 雷帕霉素 | MCE | HY-10219 | |
| 环孢素A | TargetMol | T0945 | |
| 阿达格拉西布 | TargetMol | T8369 | |
| MRTX1133 | MCE | HY-134813 | |
| BI2865 | TargetMol | T72062 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件 阅读提示：Materials and methods 2.1 |
| 不稳定突变鉴定 | 突变文库构建方法、随机突变率、筛选流程 阅读提示：Materials and methods 2.4, 2.10, 2.11 |
| 高通量筛选 | 筛选浓度、处理时间、阳性对照、Z'因子 阅读提示：Materials and methods 2.14 |
| 配体结合验证 | MST、CETSA实验条件 阅读提示：Materials and methods 2.8, 2.15 |