体外STS条件联合内分泌治疗对HR+乳腺癌细胞系和类器官的抗肿瘤活性验证
验证模拟禁食的条件（STS）是否能增强他莫昔芬和氟维司群在HR+乳腺癌细胞系和患者来源类器官中的抗肿瘤活性
使用MCF7、T47D、ZR-75-1细胞系和患者来源的HR+乳腺癌类器官，在STS条件下（低血清、低葡萄糖）联合他莫昔芬或氟维司群处理，检测细胞活力、克隆形成和类器官活力。
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模拟禁食饮食与激素治疗诱导乳腺癌消退
Fasting-mimicking diet and hormone therapy induce breast cancer regression
实验完整度
高包含体外细胞实验、患者来源类器官、小鼠异种移植模型、小鼠子宫内膜增生模型和两项患者临床试验，并进行了功能验证（基因沉默、AKT抑制剂）和机制验证（信号通路检测）
主要模型
MCF7小鼠异种移植模型 T47D小鼠异种移植模型 ZR-75-1小鼠异种移植模型 患者来源的乳腺癌类器官
重点核对
小鼠模型：6-8周龄雌性BALB/c裸鼠，皮下接种5×10^6 MCF7细胞或8×10^6 ZR-75-1细胞或5×10^6 T47D细胞 给药剂量：他莫昔芬45 mg/kg/d口服，氟维司群150 mg/kg/周皮下注射，帕博西尼65 mg/kg口服每周三次 禁食或FMD方案：每周48小时水-only禁食或FMD（48-96小时） 患者临床试验：NCT03595540和NCT03340935，FMD周期为每3-4周5天 主要检测指标：肿瘤体积、血清IGF1、胰岛素、瘦素水平，以及肿瘤中AKT、p70S6K磷酸化水平
摘要
约75%的乳腺癌表达雌激素和/或孕激素受体。内分泌治疗对这些激素受体阳性肿瘤通常有效，但原发性和获得性耐药限制了其长期获益。在这里我们显示，在激素受体阳性乳腺癌的小鼠模型中，周期性禁食或模拟禁食饮食通过降低循环中的IGF1、胰岛素和瘦素，并通过上调EGR1和PTEN抑制AKT–mTOR信号传导，增强了内分泌治疗药物他莫昔芬和氟维司群的活性。当氟维司群与帕博西尼（一种细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂）联合使用时，加入周期性模拟禁食饮食周期可促进持久的肿瘤消退并逆转对药物处理的获得性耐药。此外，禁食和模拟禁食饮食均能预防他莫昔芬诱导的子宫内膜增生。在接受雌激素治疗的激素受体阳性乳腺癌患者中，模拟禁食饮食周期引起与小鼠中观察到的类似的代谢变化，包括胰岛素、瘦素和IGF1水平降低，其中后两者在较长时间内保持低位。在小鼠中，这些持久效应与长期抗癌活性相关。这些结果支持进一步开展模拟禁食饮食作为激素受体阳性乳腺癌雌激素治疗辅助手段的临床研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 周期性禁食或模拟禁食饮食能否增强激素受体阳性乳腺癌的内分泌治疗疗效，并延迟或逆转耐药？
- 核心机制
- 禁食或FMD通过降低循环中的胰岛素、IGF1和瘦素，进而抑制PI3K–AKT–mTOR信号通路，机制涉及上调EGR1和PTEN，从而增强内分泌治疗的抗肿瘤活性。
- 主要证据
- 体外STS条件增强他莫昔芬和氟维司群在HR+乳腺癌细胞系中的抗肿瘤活性；小鼠异种移植模型中，FMD联合内分泌治疗降低循环FRFs并抑制AKT-mTOR通路；患者临床试验中，FMD cycles降低血清IGF1和瘦素。
- 研究意义
- 研究结果支持进一步开展大型临床研究，评估FMD作为激素受体阳性乳腺癌内分泌治疗辅助手段的潜力，并可能适用于其他对胰岛素、IGF1或瘦素剥夺敏感的癌症。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠异种移植模型中FMD或禁食联合内分泌治疗的抗肿瘤效果及机制验证
验证周期性FMD或禁食能否增强他莫昔芬和氟维司群在体内对HR+乳腺癌异种移植瘤的抗肿瘤效果，并探索其机制
在荷瘤小鼠（MCF7、T47D、ZR-75-1异种移植）中，给予FMD或禁食周期，单独或联合他莫昔芬或氟维司群，监测肿瘤生长、血清因子水平（IGF1、C肽、瘦素等）和肿瘤组织信号通路蛋白表达。
FRFs回补实验验证胰岛素、IGF1和瘦素的关键作用
验证降低的胰岛素、IGF1和瘦素（FRFs）是FMD增强内分泌治疗疗效的关键介质
在MCF7异种移植小鼠中，FMD联合氟维司群治疗同时补充胰岛素、IGF1和瘦素（单独或联合），观察肿瘤生长是否恢复，以及在FMD周期后停止补充是否恢复疗效。
机制研究：EGR1/PTEN介导AKT-mTOR抑制
验证FMD联合内分泌治疗通过上调EGR1和PTEN抑制AKT-mTOR信号通路，从而增强抗肿瘤活性
在细胞和肿瘤组织中检测AKT、p70S6K、4E-BP1、eIF4E磷酸化水平，以及PTEN、EGR1表达；通过shRNA敲低EGR1或PTEN或表达组成性激活AKT（myr-AKT）观察对联合治疗敏感性的影响。
联合CDK4/6抑制剂帕博西尼评估耐药逆转
验证在氟维司群基础上加入FMD和帕博西尼能否预防或逆转耐药
在MCF7异种移植模型中，单独或联合氟维司群、帕博西尼和FMD，监测肿瘤生长和进展；对获得性耐药肿瘤加入FMD观察肿瘤退缩。
评估禁食或FMD预防他莫昔芬诱导的子宫内膜增生
验证禁食或FMD是否能减轻他莫昔芬引起的子宫内膜增生和体重增加
用他莫昔芬单独或联合禁食或FMD处理雌性BALB/c小鼠5周，收集子宫称重、组织学检查，检测子宫中相关基因和蛋白表达。
患者临床试验中评估周期性FMD的效果
评估周期性FMD在激素受体阳性乳腺癌患者中的安全性和可行性，并观察其对代谢参数和临床结局的影响
两项临床试验（NCT03595540和NCT03340935）中，患者接受每3-4周5天的FMD，同时接受标准治疗，检测血清代谢参数、体重、体成分和临床反应。
评估FMD联合内分泌治疗的长期抗肿瘤效应
验证FMD联合内分泌治疗是否产生持续的抗肿瘤效应，即使停止治疗后
MCF7异种移植小鼠接受1个月的治疗（ET+FMD或单独），之后观察肿瘤生长和生存期；另一些小鼠在治疗后接种肿瘤评估肿瘤形成能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞周期和蛋白合成分析
蛋白表达检测
转录活性检测
血清因子检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MCF7细胞系 | ATCC | -- |
| T47D细胞系 | ATCC | -- | |
| ZR-75-1细胞系 | ATCC | -- | |
| 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 他莫昔芬 | Sigma Aldrich | -- |
| 氟维司群 | Sigma Aldrich（体外），AstraZeneca（体内） | -- | |
| 帕博西尼 | Selleck Chemicals（体外），Medchem Express（体内） | -- | |
| 胰岛素 | Pharmacy of IRCCS Ospedale Policlinico San Martino | -- | |
| 重组人IGF1 | Peprotech | -- | |
| 重组人瘦素 | Peprotech | -- | |
| 17β-雌二醇 | Sigma Aldrich | -- | |
| GDC0068 | SelleckChem | -- | |
| AZD5363 | SelleckChem | -- | |
| LY294002 | SelleckChem | -- | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Sigma Aldrich | -- |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | -- | |
| β-雌二醇 | Sigma Aldrich | -- | |
| 细胞活力 | 磺基罗丹明B | Sigma Aldrich | -- |
| CellTiter 96 Aqueous One检测试剂盒 | Promega | -- | |
| 类器官培养 | 基底膜提取物 | -- | -- |
| 尼龙过滤器（70微米） | Falcon | -- | |
| 类器官活力 | CellTiter-Glo 3D试剂 | Promega | -- |
| 星形孢菌素 | Sigma Aldrich | -- | |
| 蛋白检测 | 抗磷酸化AKT（Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4058 |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9552 | |
| 抗磷酸化p70S6K（Thr389）抗体 | Cell Signaling Technology | 9206 | |
| 抗p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 抗4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 4923 | |
| 抗磷酸化eIF4E（Ser209）抗体 | Cell Signaling Technology | 9741 | |
| 抗磷酸化RB（Ser807/811）抗体 | Cell Signaling Technology | 9308 | |
| 抗RB抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| 抗CCND1抗体 | Cell Signaling Technology | 2978 | |
| 抗磷酸化AMPK（Thr172）抗体 | Thermo Fisher | PA5-17831 | |
| 抗AMPK抗体 | Thermo Fisher | PA5-29679 | |
| 抗EGR1抗体 | Thermo Fisher | MA5-15008 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| PVDF膜 | Millipore S.p.A. | Immobilon-P | |
| Quantity One SW软件 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 蛋白合成分析 | Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488蛋白质合成检测试剂盒 | Life Technologies | -- |
| 高内涵成像 | PerkinElmer Operetta高内涵成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 转录活性检测 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus | -- |
| pGL3启动子质粒 | Promega | -- | |
| pS2/TFF1报告载体 | -- | -- | |
| pRLSV40质粒 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 基因表达分析 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| Agilent Human GE 4x44K V2微阵列 | Agilent | G2519F-026652 | |
| Agilent DNA微阵列扫描仪 | Agilent | G2505C | |
| 分子检测 | Mycoalert试剂盒 | Promega | -- |
| ELISA | 小鼠C肽ELISA试剂盒 | Alpco | -- |
| 人/小鼠IGF1、IGFBP1、IGFBP3、C肽、瘦素、脂联素ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Envigo | -- |
| NOD/SCIDγ小鼠 | Charles River Laboratories | -- | |
| 17β-雌二醇释放丸 | Innovative Research of America | -- | |
| 他莫昔芬（体内） | AstraZeneca | -- | |
| 氟维司群（Faslodex） | AstraZeneca | -- | |
| 帕博西尼（体内） | Medchem Express | -- | |
| 人重组IGF1 | Peprotech | -- | |
| 人重组瘦素 | Peprotech | -- | |
| 胰岛素给药 | 优泌林R | Eli Lilly | -- |
| 组织学 | Superfrost Plus显微镜载玻片 | Thermo Scientific | -- |
| Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | D2H10 | |
| Dako EnVision双链系统HRP | Dako | -- | |
| DAB检测试剂盒 | Dako | -- | |
| 临床研究 | Glucomen Areo 2k血糖仪 | Menarini | -- |
| BIA 101生物电阻抗分析仪 | Akern | -- | |
| Aminotrofic氨基酸补充剂 | -- | -- | |
| Xentigen FMD | L-Nutra | -- | |
| 类器官培养 | Multi-drop Combi试剂分液器 | Thermo Scientific | -- |
| Tecan d300e数字分液器 | Tecan | -- | |
| 基因操作 | pBABE-puro载体 | Addgene | -- |
| pMKO-GFP-shRNA载体 | Addgene | -- | |
| pLKO-EGR1-shRNA载体 | Sigma Aldrich | TRCN0000013833, |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和STS条件 | 细胞系：MCF7、T47D、ZR-75-1；STS培养基：1% FBS，0.5 g/L葡萄糖；对照培养基：10% FBS，1 g/L葡萄糖 阅读提示：Methods: Cell lines and reagents; Cell viability assays |
| 类器官培养 | 类器官系：33T、209M、213M；STS条件：0.5 g/L葡萄糖，B27浓度0.1×；他莫昔芬浓度：2.5 μM（209M）或13 μM（33T和213M） 阅读提示：Methods: Organoid culture and viability assays |
| 体外药物处理 | 他莫昔芬浓度：5 μM；氟维司群浓度：10 μM；处理时间：24小时（蛋白检测）或96小时（细胞活力） 阅读提示：Methods: Immunoblotting; Cell viability assays |
| 小鼠异种移植模型 | 小鼠品系：6-8周龄雌性BALB/c裸鼠或NOD/SCIDγ；细胞接种：5×10^6 MCF7、8×10^6 ZR-75-1或5×10^6 T47D皮下注射，或3×10^6 MCF7原位注射；雌激素丸植入 阅读提示：Methods: Animal models |
| 动物给药剂量和方案 | 他莫昔芬：45 mg/kg/d口服；氟维司群：150 mg/kg/周皮下注射；帕博西尼：65 mg/kg口服每周三次；FMD：每周48-96小时；禁食：每周48小时水-only 阅读提示：Methods: Animal models |
| FRFs回补实验 | 胰岛素：20 mU/kg/d皮下注射（FMD日）；IGF1：200 μg/kg每日两次皮下注射（FMD日）；瘦素：1 mg/kg每日一次皮下注射（周一至周五） 阅读提示：Methods: Animal models; Figure 1c legend |
| 肿瘤体积和终点 | 肿瘤体积计算公式：w2×W×π/6；最大允许体积：1500 mm3；耐药标准：肿瘤体积增至初始体积的4倍或最小体积的4倍 阅读提示：Methods: Animal models |
| 患者临床试验 | 试验编号：NCT03595540和NCT03340935；FMD方案：5天FMD，每3-4周；平均周期数：6.8（NCT03595540）和5.5（NCT03340935） 阅读提示：Methods: Clinical studies of FMDs in patients undergoing ET for HR+ BC |