构建Notch信号嵌合体模型
通过诱导型遗传嵌合体在体内标记和调控不同Notch信号水平的内皮细胞，以追踪其命运。
使用iChr-Notch-Mosaic、iMb-Notch-Mosaic等小鼠，结合Tie2-cre或Pdgfb-icreERT2等Cre驱动，诱导内皮细胞表达不同Notch信号调节因子（DN-MAML1、N1ICDP、Rbpj敲除等），并通过荧光蛋白标记。
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动脉化需要及时抑制细胞生长
Arterialization requires the timely suppression of cell growth
实验完整度
高结合诱导型遗传嵌合体、谱系追踪、RNA-seq、qRT-PCR及功能实验，验证Notch-MYC通路在动脉化中的作用，并用双重敲除拯救实验证实机制。
主要模型
小鼠胚胎冠状动脉内皮细胞 小鼠视网膜血管内皮细胞 HUVEC细胞系
重点核对
诱导Rbpj或Dll4敲除后，MYC表达上调，细胞增殖增加，动脉形成受阻；双重敲除Myc可恢复动脉形成（Fig. 4, Extended Data Fig. 7-9） Notch信号低的内皮细胞（DN-MAML1或Rbpj敲除）在动脉中频率降低，但高Notch信号（N1ICDP）细胞可形成静脉，表明Notch并非动脉命运的决定因素（Fig. 1, Extended Data Fig. 2） Notch激活在体内抑制MYC表达，但在体外HUVECs中Notch激活对MYC表达无显著影响，提示体内微环境的重要性（Extended Data Fig. 6） VEGFR2-high细胞（MbTomato+）p-ERK高但MYC低，形成动脉；VEGFR2-low细胞（MbYFP+）不形成动脉，表明高VEGF-ERK信号通过抑制MYC促进动脉化（Fig. 3）
摘要
动脉的形成被认为是通过在一部分随后将经历含氧血流量增加的血管中诱导高度保守的动脉遗传程序而发生的1,2。动脉特化的初始步骤需要VEGF和Notch信号通路3–5。在这里，我们结合诱导型遗传嵌合体和转录组学来调节并定义这些信号通路在细胞增殖、动静脉分化和动员中的功能。我们表明，具有高VEGF或Notch信号水平的内皮细胞固有地偏向于动员并形成动脉；然而，它们并非遗传上预先决定的，也可以形成静脉。在机制上，我们发现在动脉前毛细血管中增加的VEGF和Notch信号水平抑制了MYC依赖的代谢和细胞周期活动，并促进了内皮细胞并入动脉。嵌合体谱系追踪研究表明，缺乏Notch–RBPJ转录激活复合物的内皮细胞很少形成动脉；然而，当MYC功能被抑制时，这些细胞重新获得了形成动脉的能力。因此，动脉的发育不需要直接诱导Notch依赖性动脉分化程序，而是依赖于及时抑制内皮细胞周期进程和代谢，这一过程先于动脉动员和完全分化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Notch信号在动脉化过程中是直接诱导动脉分化程序，还是通过抑制细胞增殖和代谢来允许动脉形成？
- 核心机制
- Notch-RBPJ信号通过抑制MYC依赖的细胞周期和代谢活动，促进内皮细胞静脉前状态向动脉转化，而非直接诱导动脉基因表达。
- 主要证据
- 通过诱导型遗传嵌合体（iChr-Notch-Mosaic、iFlpMTomato-cre/MYfp）和转录组学分析发现，Notch低或缺失的内皮细胞中MYC靶基因上调，增殖增加，动脉形成受阻；而同时敲除Myc可恢复动脉形成。
- 研究意义
- 为理解动脉化过程提供了新机制，可能有助于在组织生长、再生或缺血性心血管疾病中更好地诱导动脉化过程（作者在讨论中提出）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析Notch缺失的影响
分析Dll4或Rbpj缺失后内皮细胞的基因表达变化，以揭示Notch调控的下游通路。
从Dll4敲除（Dll4KO-Pdgfb-24h）和Rbpj敲除（RbpjKO-iEC）小鼠分离冠状动脉内皮细胞，进行RNA-seq，并分析与野生型对照的差异表达基因。
验证Notch-MYC轴的功能
确定MYC是否是Notch调控动脉化的关键下游介质。
通过遗传嵌合体单独敲除Myc、双敲除Rbpj/Myc或Dll4/Myc，分析内皮细胞增殖、动脉特异性基因表达和动脉形成变化。
评估VEGFR2信号水平的作用
研究不同VEGFR2信号水平对内皮细胞动脉形成的影响。
使用iMb-Vegfr2-Mosaic小鼠，使内皮细胞表达组成性激活型VEGFR2（VEGFR2Ac）或激酶缺陷型（VEGFR2TK-），分析其发育成动脉或静脉的倾向，并检测p-ERK和MYC水平。
体外验证Notch对MYC的调控
检查Notch激活是否直接调节MYC表达，以及是否依赖体内环境。
在HUVECs中通过DLL4配体刺激或过表达N1ICD-V5激活Notch信号，检测MYC蛋白和mRNA水平变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和体外处理 | 人脐静脉内皮细胞 | Lonza | CC-2519 |
| 内皮基础培养基 | Lonza | -- | |
| 重组人DLL4蛋白 | R&D Systems | -- | |
| 多西环素 | Sigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | -- | |
| 内皮细胞分离和RNA提取 | I型胶原酶 | Thermo Fisher | -- |
| 分散酶II | Thermo Fisher | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| APC标记的大鼠抗小鼠CD31抗体 | BD Pharmigen | 551262 | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| RNA微提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4368814 |
| Taqman预扩增预混液 | Thermo Fisher | -- | |
| Taqman通用预混液 | Thermo Fisher | -- | |
| AB7900热循环仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- | |
| M-MLV逆转录酶 | Thermo Fisher | -- | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot分析 | RIPA裂解液 | Sigma | -- |
| c-MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 9402 | |
| N1ICD抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 | |
| V5抗体 | Cell Signaling Technology | 13202 | |
| 微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2148 | |
| Trans Turbo印迹系统 | Bio-Rad | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 下一代测序 | SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒 | Clontech-Takara | -- |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 整体免疫荧光和成像 | Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 |
| Leica SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Leica SP8 STED共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Leica SP8 Navigator共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 生物素化异凝集素B4 | Vector Labs | B-1205 | |
| 视网膜免疫染色 | Alexa偶联二抗 | Thermo Fisher | -- |
| 整体免疫荧光和成像 | Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 |
| 动脉整体免疫荧光 | 甲醛 | PanReac ApplyChem | 2529311212 |
| 免疫荧光（冷冻切片） | OCT包埋剂 | Sakura | -- |
| Leica CM1950冷冻切片机 | Leica | -- | |
| p-ERK染色 | TSA Plus荧光素系统 | PerkinElmer Life | NEL774 |
| 小鼠处理 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | H6278 | |
| 聚氧乙烯蓖麻油EL | Sigma-Aldrich | C5135 | |
| 体内EdU标记 | 5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷 | Invitrogen | A10044 |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647成像试剂盒 | Invitrogen | C10340 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒 | Invitrogen | C10337 | |
| 超声分析 | Vevo 2100超声系统 | VisualSonics | -- |
| 细胞培养和体外处理 | DBZ（γ-分泌酶抑制剂） | CalBiochem | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- | |
| 聚凝胺 | Santa Cruz | -- | |
| 遗传霉素 | Invitrogen | -- | |
| DLL4配体 | R&D Systems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 遗传嵌合体诱导 | 小鼠品系和等位基因组合；Cre驱动（Tie2-cre、Pdgfb-icreERT2等）；他莫昔芬或4-OH他莫昔芬剂量和给药方式；诱导时间点。 阅读提示：Methods: Mice; 扩展数据图1和图2等位基因示意图 |
| 内皮细胞分离和RNA-seq | 组织消化酶（胶原酶I、分散酶II、DNaseI）浓度和消化时间；FACS抗体和分选策略；RNA提取方法和测序平台。 阅读提示：Methods: Endothelial cell isolation, RNA extraction and qRT-PCR; Next-generation sequencing |
| Dll4和Rbpj敲除时间窗口 | Dll4敲除：E13.5诱导，E14.5收集；Rbpj敲除：E12.5诱导，E15.5收集。确保敲除效率。 阅读提示：Methods: Endothelial cell isolation...; 扩展数据图4 |
| 增殖检测 | EdU注射剂量（50 μg/g）和标记时间（1小时）；固定和通透条件。 阅读提示：Methods: In vivo EdU labelling and EC proliferation detection |
| 体外Notch激活实验 | DLL4包被浓度（500 ng/ml）；DBZ浓度（0.1 μM）；N1ICD-V5诱导剂量（200 ng/ml doxycycline）和处理时间。 阅读提示：Methods: Cell culture and in vitro cell treatments |
| 动脉表型分析 | 动脉标记（CX40、DLL4等）；染色和成像条件；统计分析组数和样本量。 阅读提示：结果及图注；Methods: Whole-mount immunofluorescence... |