poly(UG)加尾RNA在基因组保护和表观遗传继承中的作用

poly(UG)-tailed RNAs in genome protection and epigenetic inheritance

作者信息Aditi Shukla, Jenny Yan, Daniel J Pagano, Anne E Dodson, Yuhan Fei, Josh Gorham, J G Seidman, Marvin Wickens, Scott Kennedy

PMID32499657

期刊Nature

发布时间2020-06

DOI10.1038/s41586-020-2323-8

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实验完整度

高

包含体外RNA注射、体内pUG PCR检测、RNA-seq、LC-MS/MS蛋白互作、小RNA测序、遗传杂交等多层级功能与机制验证。

主要模型

秀丽隐杆线虫 gfp::h2b转基因线虫 oma-1(zu405ts)突变体 rde-1(ne219)突变体

重点核对

RDE-3活性：rde-3(ne3370)缺失催化残基，rde-3(ne298)错义突变 pUG尾长度：>8个3'UG重复（14,18,40有效；1,5,8无效） RNA注射剂量：0.5pmol/ul体外转录RNA 共注射标记：pmyo-2::mCherry::unc-54 3'UTR (pCFJ90) 2.5ng/ul WAGO突变体（MAGO12）影响跨代维持

摘要

转座元件在所有生物体中威胁基因组完整性。MUT-2/RDE-3是一种核糖核苷酸转移酶，在秀丽隐杆线虫中为转座子沉默和RNA干扰(RNAi)所必需。当在异源表达系统中与RNA结合时，RDE-3可以在这些RNA的3'端添加长段非模板化的交替尿苷(U)和鸟苷(G)核糖核苷酸(poly(UG)或pUG尾)。在这里，我们展示了在其自然环境中，RDE-3为RNAi靶标以及转座子RNA添加pUG尾。具有超过16个完美交替的3'U和G核苷酸的pUG尾将RNA片段转化为基因沉默的媒介。pUG尾通过招募RNA依赖性RNA聚合酶(RdRPs)促进基因沉默，RdRPs使用pUG加尾RNA(pUG RNA)作为模板合成小干扰RNA(siRNA)。我们的结果表明，pUG RNA模板化的siRNA合成和siRNA指导的mRNA pUG化循环是dsRNA指导的秀丽隐杆线虫生殖系跨代表观遗传继承的基础。我们推测这种pUG RNA/siRNA沉默循环允许亲本将不受欢迎或寄生性遗传元件的表达抑制接种给后代。

检测RNAi靶标mRNA的pUG化

验证RDE-3是否在体内对RNAi靶标添加pUG尾

使用(AC)9寡核苷酸反转录总RNA，进行pUG PCR检测oma-1、gfp和dpy-11 mRNA的pUG尾，并通过Sanger和MiSeq测序验证。

定义功能性pUG RNA的特征

确定pUG RNA触发基因沉默所需的结构特征

将体外转录的pUG RNA注射到rde-1(ne219)突变体生殖系，评估不同长度、序列、位置和链方向的pUG尾对基因沉默的影响。

鉴定内源性pUG RNA靶标

确定RDE-3在生理条件下pUG化的内源RNA

使用pUG PCR检测Tc1、Tc4v、Tc5、Cer3等转座子RNA和预测的蛋白编码RNA的pUG化；通过RNA-seq比较WT和rde-3(-)动物的转录组。

确定pUG RNA在生殖颗粒中的定位

验证pUG RNA的亚细胞定位及其与Mutator foci的关系

使用RNA FISH检测pUG RNA，结合免疫荧光检测RDE-3蛋白，观察其在生殖细胞核周的定位。

检验pUG RNA作为RdRP模板

确定pUG RNA是否被RdRP用作模板合成siRNA

通过体外pull-down验证RRF-1与pUG RNA的结合；注射带有SNP的pUG RNA，进行小RNA测序检测22G siRNA的合成。

评估pUG RNA在跨代遗传中的作用

验证pUG RNA是否足以诱导跨代表观遗传继承，并检验循环模型

注射pUG RNA后监测多代基因沉默；使用遗传杂交、MAGO12突变体、SNP标记和后代pUG PCR分析验证pUG RNA的跨代维持机制。

实验环节	名称	品牌	货号
RNA提取	TRIzol试剂	Life Technologies	15596018
反转录	SuperScript III第一链合成系统	Invitrogen	18080051
PCR	Taq DNA聚合酶	New England BioLabs	M0273
凝胶提取	QIAquick凝胶提取试剂盒	Qiagen	28706
TA克隆	pGEM-T Easy载体系统	Promega	A1360
5-alpha感受态大肠杆菌	NEB	C2987H
质粒提取	QIAprep离心柱小提试剂盒	Qiagen	27106
qPCR	iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	--
体外转录	MEGAscript T7转录试剂盒	Invitrogen	AM1334
RNA FISH	RNA FISH探针（Alexa647标记(AC)9）	Integrated DNA Technologies	--
ama-1 mRNA FISH探针	Stellaris	SMF-6011-1
免疫荧光	GFP抗体	Abcam	ab290
山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21429
封片	VECTASHIELD抗淬灭封片剂（含DAPI）	Vector Laboratories	H-1000
RNA-seq	Dynabeads mRNA直接提取试剂盒	Invitrogen	61011
DNA聚合酶I	Invitrogen	11917010
Nextera XT DNA文库制备试剂盒	Illumina	FC-131-1024
RNA pull-down	cOmplete蛋白酶抑制剂	Roche	11697498001
RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂	Invitrogen	10777019
Dynabeads MyOne链霉亲和素磁珠	Invitrogen	65001
Western blot	2x Laemmli样品缓冲液	Bio-Rad	1610737
4-15% Mini-PROTEAN TGX预制蛋白胶	Bio-Rad	4561086
HA标签兔单克隆抗体	Cell Signaling	3724
IRDye 800CW山羊抗兔IgG	LI-COR	926-32211
Odyssey Fc双模式成像系统	LI-COR	--
RNAi	HT115大肠杆菌	--	--
L4440载体	Addgene	1654
RNA注射	pCFJ90质粒	Addgene	19327
显微注射	Axio Observer.Z1荧光显微镜	Zeiss	--
Axio Zoom.V16荧光体视显微镜	Zeiss	--
RNA完整性检测	TapeStation 2200	Agilent	--

实验环节

名称

品牌

货号

RNA提取

TRIzol试剂

Life Technologies

15596018

反转录

SuperScript III第一链合成系统

Invitrogen

18080051

PCR

Taq DNA聚合酶

New England BioLabs

M0273

凝胶提取

QIAquick凝胶提取试剂盒

Qiagen

28706

TA克隆

pGEM-T Easy载体系统

Promega

A1360

5-alpha感受态大肠杆菌

NEB

C2987H

质粒提取

QIAprep离心柱小提试剂盒

Qiagen

27106

qPCR

iTaq Universal SYBR Green Supermix

Bio-Rad

体外转录

MEGAscript T7转录试剂盒

Invitrogen

AM1334

RNA FISH

RNA FISH探针（Alexa647标记(AC)9）

Integrated DNA Technologies

ama-1 mRNA FISH探针

Stellaris

SMF-6011-1

免疫荧光

GFP抗体

Abcam

ab290

山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 555

Invitrogen

A-21429

封片

VECTASHIELD抗淬灭封片剂（含DAPI）

Vector Laboratories

H-1000

RNA-seq

Dynabeads mRNA直接提取试剂盒

Invitrogen

61011

DNA聚合酶I

Invitrogen

11917010

Nextera XT DNA文库制备试剂盒

Illumina

FC-131-1024

RNA pull-down

cOmplete蛋白酶抑制剂

Roche

11697498001

RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂

Invitrogen

10777019

Dynabeads MyOne链霉亲和素磁珠

Invitrogen

65001

Western blot

2x Laemmli样品缓冲液

Bio-Rad

1610737

4-15% Mini-PROTEAN TGX预制蛋白胶

Bio-Rad

4561086

HA标签兔单克隆抗体

Cell Signaling

3724

IRDye 800CW山羊抗兔IgG

LI-COR

926-32211

Odyssey Fc双模式成像系统

LI-COR

RNAi

HT115大肠杆菌

L4440载体

Addgene

1654

RNA注射

pCFJ90质粒

Addgene

19327

显微注射

Axio Observer.Z1荧光显微镜

Zeiss

Axio Zoom.V16荧光体视显微镜

Zeiss

RNA完整性检测

TapeStation 2200

Agilent

环节	核对要点
RNA干扰处理	dsRNA喂食菌株HT115，表达L4440空载体或目标基因dsRNA；培养基含1mM IPTG和25μg/ml carbenicillin；处理时间3-4天阅读提示：Methods: RNAi
pUG PCR检测	反转录引物(AC)9；逆转录酶Superscript III；巢式PCR；gsa-1作为对照阅读提示：Methods: pUG PCRs and qRT-PCRs
RNA注射	RNA浓度0.5pmol/ul；共注射标记pCFJ90 2.5ng/ul；注射部位：生殖系；常用受体rde-1(ne219)以排除dsRNA污染阅读提示：Methods: pUG RNA injections
pUG RNA功能特征	pUG尾长度>8个UG重复；3'端位置；正义链；RNA片段>50nt 阅读提示：Main text: pUG RNAs drive gene silencing; Extended Data Fig. 4
RNA pull-down	5'生物素化RNA寡核苷酸；(UG)18等；链霉亲和素磁珠；裂解缓冲液成分；LC-MS/MS分析阅读提示：Methods: pUG RNA chromatography
小RNA测序	注射含SNP的pUG RNA；注射后1-4小时收集或后代收集；小RNA提取和文库构建；22G siRNA分析阅读提示：Methods: Small RNA sequencing and analysis
跨代遗传实验	注射pUG RNA后每代挑选5只动物传代；监测表型；使用MAGO12或rde-3(ne298)突变体阅读提示：Methods: pUG RNA injections; Fig. 5; Extended Data Fig. 8

环节

核对要点

RNA干扰处理

dsRNA喂食菌株HT115，表达L4440空载体或目标基因dsRNA；培养基含1mM IPTG和25μg/ml carbenicillin；处理时间3-4天

阅读提示：Methods: RNAi

pUG PCR检测

反转录引物(AC)9；逆转录酶Superscript III；巢式PCR；gsa-1作为对照

阅读提示：Methods: pUG PCRs and qRT-PCRs

RNA注射

RNA浓度0.5pmol/ul；共注射标记pCFJ90 2.5ng/ul；注射部位：生殖系；常用受体rde-1(ne219)以排除dsRNA污染

阅读提示：Methods: pUG RNA injections

pUG RNA功能特征

pUG尾长度>8个UG重复；3'端位置；正义链；RNA片段>50nt

阅读提示：Main text: pUG RNAs drive gene silencing; Extended Data Fig. 4

RNA pull-down

5'生物素化RNA寡核苷酸；(UG)18等；链霉亲和素磁珠；裂解缓冲液成分；LC-MS/MS分析

阅读提示：Methods: pUG RNA chromatography

小RNA测序

注射含SNP的pUG RNA；注射后1-4小时收集或后代收集；小RNA提取和文库构建；22G siRNA分析

阅读提示：Methods: Small RNA sequencing and analysis

跨代遗传实验

注射pUG RNA后每代挑选5只动物传代；监测表型；使用MAGO12或rde-3(ne298)突变体

阅读提示：Methods: pUG RNA injections; Fig. 5; Extended Data Fig. 8

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