建立小鼠皮肤扩张模型
模拟人类皮肤扩张手术，以便在体内研究拉伸对表皮的影响。
在小鼠背部皮下植入4ml自膨胀水凝胶，监测扩张过程中表皮细胞面积、增殖和分化变化。
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单细胞分辨率下拉伸介导的皮肤扩张机制
Mechanisms of stretch-mediated skin expansion at single-cell resolution
实验完整度
高包含克隆分析、单细胞RNA-seq、ATAC-seq、多种条件性基因敲除小鼠及药理学抑制实验，涵盖从表型到信号通路的多个独立证据层级。
主要模型
小鼠背部皮肤表皮 K14CREER/Rosa-Confetti小鼠 Diaph3条件性敲除小鼠 Myh9条件性敲除小鼠 YAP-TAZ条件性敲除小鼠
重点核对
自膨胀水凝胶植入小鼠背部皮肤下，体积4ml，位置靠近颈部 BrdU注射剂量50 mg/kg，注射后4小时取材 条件性基因敲除使用他莫昔芬诱导，剂量2.5mg/30g体重，连续5天 MEK抑制剂Trametinib剂量2mg/kg，口服灌胃，连续至少7天 MAL抑制剂CCG203971剂量100mg/kg，腹腔注射 样品量：克隆分析中每组至少3只小鼠，单细胞测序每组数千个细胞
摘要
皮肤因拉伸而生长的能力已在重建手术中被利用。尽管表皮细胞对拉伸的响应已在体外研究中得到探索，但机械力如何在体内影响其行为仍不清楚。在此，我们开发了一种小鼠模型，可以在单细胞分辨率下研究拉伸对皮肤表皮的影响。我们采用结合克隆分析与定量建模及单细胞RNA-seq的多学科方法，表明拉伸通过创建表皮干细胞（SC）更新活动的瞬时偏向来诱导皮肤扩张，而第二基底层祖细胞亚群仍致力于分化。转录和染色质分析揭示了细胞状态和基因调控网络如何被拉伸调节。利用药理学抑制剂和小鼠突变体，我们在体内以单细胞分辨率定义了控制拉伸介导组织扩张的逐步机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 机械拉伸如何在体内调节表皮干细胞的行为，从而驱动皮肤扩张？
- 核心机制
- 拉伸通过肌动蛋白细胞骨架重构（涉及Diaph3和Myh9）激活YAP和MAL核转位，并激活MEK/ERK/AP1信号通路，最终促进干细胞更新偏向，同时维持分化。
- 主要证据
- 主要通过克隆分析显示扩张促进干细胞更新偏向，单细胞RNA-seq鉴定出应激干细胞状态，以及基因敲除和药理学抑制实验证明Diaph3、Myh9、YAP/TAZ和MAL/SRF对拉伸诱导的增殖和屏障适应至关重要。
- 研究意义
- 该研究揭示了皮肤拉伸扩张的细胞和分子机制，为理解组织再生和潜在的临床应用提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
克隆分析追踪细胞命运
确定拉伸过程中表皮干细胞和祖细胞的命运动态。
使用K14CREER/Rosa-Confetti小鼠进行克隆追踪，结合数学模型分析克隆大小和持续性的变化。
转录组和染色质分析
鉴定拉伸响应的关键基因和转录因子，以及染色质重塑。
通过FACS分选基底层细胞进行微阵列分析、ATAC-seq和单细胞RNA-seq。
功能验证信号通路
验证肌动蛋白细胞骨架、YAP/TAZ和MAL/SRF通路在拉伸响应中的功能作用。
利用条件性基因敲除小鼠（Diaph3 cKO, Myh9 cKO, YAP-TAZ cKO）和药理学抑制剂（Trametinib, Pimasertib, CCG203971）处理，检测增殖、分化和屏障功能变化。
单细胞RNA-seq分析信号通路抑制效应
确定MEK和MAL抑制对细胞异质性和干细胞状态的影响。
在MEK/ERK/AP1和MAL/SRF抑制条件下，对扩张D2的表皮细胞进行单细胞RNA-seq。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 半球形自膨胀组织扩张器 | Osmed™ | -- |
| 他莫昔芬 | Sigma | -- | |
| 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 | -- | -- | |
| 药物处理 | 曲美替尼 | -- | -- |
| 匹马替尼 | -- | -- | |
| CCG203971 | Cayman Chemical | -- | |
| 地塞米松 | Sigma | -- | |
| 细胞增殖检测 | 溴脱氧尿苷 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗K14抗体 | Thermo Fischer | -- |
| 抗整合素β4抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗BrdU抗体 | Abcam | -- | |
| 免疫染色 | 抗YAP1抗体 | Proteintech | -- |
| 抗MAL抗体 | Sigma | -- | |
| 抗α-连环蛋白抗体 | Sigma | -- | |
| 抗α18-连环蛋白抗体 | -- | -- | |
| 抗纽蛋白抗体 | Millipore | -- | |
| 抗K1抗体 | Covance/IMTEC | PRB-165P | |
| 抗K10抗体 | Covance/IMTEC | PRB-159P | |
| 抗p63抗体 | Abcam | ab124762 | |
| 抗KLF4抗体 | Abcam | ab129473 | |
| 抗pSTAT3抗体 | Cell signaling | 9145 | |
| 抗p120-连环蛋白抗体 | Invitrogen | PA5-82545 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | ebioscience | 14-3249-82 | |
| 抗ZO-1抗体 | Invitrogen | 61-7300 | |
| 抗Claudin-1抗体 | Thermo Scientific | 51-9000 | |
| 抗桩蛋白抗体 | Abcam | 32084 | |
| 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 553081 | |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab125212 | |
| 免疫组织化学 | 抗YAP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-15407 |
| 抗TAZ抗体 | Sigma-Aldrich | HPA007415 | |
| 抗cFOS抗体 | Proteintech | 26192-1-AP | |
| 抗MYH9抗体 | Sigma | HPA001644 | |
| 抗pERK抗体 | Cell signaling | 4370S | |
| 抗FOSL1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28310 | |
| 荧光染色 | Hoechst染料 | -- | -- |
| 鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞分选 | PE偶联抗α6整合素抗体 | ebioscience | -- |
| FITC偶联抗α6整合素抗体 | ebioscience | -- | |
| 生物素化CD34抗体 | BD Biosciences | 553858 | |
| 流式分析 | FITC偶联抗β1整合素抗体 | BD Bioscience | 555005 |
| PE偶联抗α2整合素抗体 | BD Bioscience | 553858 | |
| RNA提取 | RNAeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| PCR | Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- |
| ATAC-seq | Nextera DNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| MiniElute纯化试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| BluePippin自动化核酸回收系统 | Sage Sciences | -- | |
| 单细胞RNA-seq | Chromium单细胞3'微流控芯片 | 10X Genomics | PN-120232 |
| Chromium单细胞3'文库制备试剂盒 | 10X Genomics | PN-120233 | |
| Illumina HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| 透射电镜 | JEOL JEM1400透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| Olympus Quemesa 11 Mpxl相机 | Olympus | -- | |
| 组织透明化 | Sca/eCUBIC-1溶液 | -- | -- |
| Sca/eCUBIC-2溶液 | -- | -- | |
| 核染色 | 7-AAD | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 显微成像 | LSM780NLO共聚焦系统 | Zeiss | -- |
| Observer Z1倒置显微镜 | Zeiss | -- | |
| Chameleon Vision II多光子激光器 | Coherent Europe | -- | |
| LSM780共聚焦系统 | Zeiss | -- | |
| AxioExaminer Z1正置显微镜 | Zeiss | -- | |
| 切片 | CM3050S Leica冷冻切片机 | Leica Mycrosystems | -- |
| 图像分析 | ImageJ | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、体重，以及水凝胶扩张器的体积和植入位置 阅读提示：Methods: Mouse strains, Expander experiments |
| 克隆分析 | 他莫昔芬诱导剂量和时间，克隆分析时间点和样本量 阅读提示：Methods: Clonal induction in K14CREER-RosaConfetti mice, Figure 2 legend |
| 基因敲除 | 他莫昔芬给药方案（剂量、频率、给药途径） 阅读提示：Methods: Inducing YAP-TAZ and MYH9 deletion |
| 药物处理 | Trametinib、Pimasertib、CCG203971的剂量、给药途径和持续时间 阅读提示：Methods: Mouse treatments |
| 单细胞RNA-seq | 细胞分选门控策略（整合素α6高/CD34阴性）、上样细胞数量、10X Genomics试剂盒版本和测序平台 阅读提示：Methods: Dissociation of epidermal cells, cell sorting, single-cell RNA sequencing |