EAE模型建立与DC分析
鉴定CNS自身免疫中DC的转录和代谢特征。
对MOG35-55免疫的B6小鼠诱导EAE，分离CNS DC进行scRNA-seq和RNA-seq分析，并检测HIF-1α表达。
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乳酸通过稳定树突状细胞中的HIF-1α限制中枢神经系统自身免疫
Lactate limits CNS autoimmunity by stabilizing HIF-1α in dendritic cells
实验完整度
高包含单细胞及批量转录组、代谢分析，细胞特异性基因敲除小鼠（HIF-1αItgax、Xbp1Itgax），体外DC功能验证、机制研究（NDUFA4L2、mtROS、XBP1）及工程益生菌体内验证。
主要模型
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC） 小鼠EAE模型（MOG35-55免疫） 工程益生菌EcNLac处理的小鼠 人外周血来源DC和T细胞共培养
重点核对
EAE诱导：MOG35-55（150 μg）与完全弗氏佐剂混合，皮下注射，并注射百日咳毒素 乳酸剂量：L-LA或D-LA 125 mg/kg，每日给药 BMDC分化：20 ng/ml GM-CSF培养8天 DC刺激：LPS 100 ng/ml处理6小时，乳酸浓度0.1-10 mM 基因敲除小鼠：ItgaxCreHif1aflox（HIF-1αItgax）和ItgaxCreXbp1flox（Xbp1Itgax）
摘要
树突状细胞（DCs）在自身反应性致病性T细胞的发育和激活中起作用。与DC功能相关的遗传变异已与自身免疫性疾病相关联，因此DC是此类疾病有吸引力的治疗靶点。然而，开发针对DC的自身免疫疗法需要鉴定调节DC功能的机制。在这里，我们利用单细胞和批量转录及代谢分析结合细胞特异性基因扰动研究，鉴定了一个在DC中运作的负反馈调节环路，以限制免疫病理。具体来说，我们发现由活化的DC和其他免疫细胞产生的乳酸，通过缺氧诱导因子1α（HIF-1α）介导的机制增强NDUFA4L2的表达。NDUFA4L2限制线粒体活性氧的产生，这些活性氧激活DC中XBP1驱动的转录模块，该模块参与控制致病性自身免疫T细胞。我们还工程化了一种产生乳酸并通过对DC中HIF-1α–NDUFA4L2信号的激活抑制T细胞自身免疫的益生菌。总之，我们确定了一种调节DC功能的免疫代谢通路，并开发了一种用于其治疗性激活的合成益生菌。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DCs在自身免疫中如何被调控，以及乳酸是否通过HIF-1α影响DC功能？
- 核心机制
- 乳酸通过HIF-1α上调NDUFA4L2，抑制线粒体复合物I活性，减少mtROS产生，从而抑制XBP1驱动的促炎转录程序在DCs中的激活。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和RNA-seq分析EAE小鼠DC转录组，HIF-1α敲除加重EAE，乳酸处理减少促炎细胞因子，NDUFA4L2敲低逆转乳酸效应，XBP1缺失改善EAE，工程益生菌EcNLac产生D-LA激活该通路缓解EAE。
- 研究意义
- 揭示了乳酸-HIF-1α-NDUFA4L2信号轴限制DC促炎反应，为自身免疫病提供治疗靶点，并开发了工程益生菌用于该通路的治疗性激活。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HIF-1α在DC中的功能验证
确定DC中HIF-1α对EAE和T细胞反应的影响。
生成HIF-1αItgax小鼠，诱导EAE，评估疾病严重程度、CNS和脾脏中T细胞亚群及DC转录组变化。
乳酸对DC的效应及机制
测试乳酸是否通过HIF-1α影响DC功能及潜在机制。
用L-LA或D-LA处理BMDC或人DC，检测HIF-1α、促炎细胞因子表达、OCR、mtROS、XBP1剪接及NDUFA4L2表达，并使用siRNA敲低HIF1A、NDUFA4L2等。
NDUFA4L2在乳酸效应中的作用
验证NDUFA4L2是否是乳酸–HIF-1α通路的下游效应分子。
过表达或敲低Ndufa4l2，观察对DC细胞因子、OCR和mtROS的影响，并检测乳酸对Ndufa4l2启动子活性的影响。
mtROS和XBP1介导的促炎反应
证明乳酸通过减少mtROS抑制XBP1活性，从而降低促炎基因表达。
用mitoPQ（mtROS诱导剂）和mitoTempo（清除剂）处理BMDC，检测XBP1剪接、细胞因子表达和XBP1启动子结合。Xsplice实验检测XBP1 mRNA剪接，ChIP检测XBP1结合。
XBP1在DC中的功能验证
验证XBP1在DC中促进致病性T细胞反应。
使用Xbp1Itgax小鼠诱导EAE，评估疾病严重程度、T细胞反应和DC转录组。
工程益生菌EcNLac的构建和验证
构建产D-LA的工程益生菌并验证其通过DC中HIF-1α–NDUFA4L2信号抑制EAE。
敲除E. coli Nissle 1917的pta基因并表达ldhA，构建EcNLac。口服给予小鼠EcNLac或EcN，检测D-LA水平、DC中的HIF-1α和NDUFA4L2表达、XBP1剪接、T细胞反应和EAE严重度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EAE诱导 | MOG35-55肽 | Genemed Synthesis | 110582 |
| 完全弗氏佐剂 | BD Biosciences | -- | |
| 百日咳毒素 | List Biological Laboratories | 180 | |
| 细胞培养 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-03 |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 含GlutaMAX的DMEM/F12 | Life Technologies | 10565042 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10438026 | |
| DC刺激 | 大肠杆菌0111:B4脂多糖 | InvivoGen | tlrl-3pelps |
| L-乳酸钠 | Sigma-Aldrich | 71718 | |
| D-乳酸钠 | Millipore Sigma | 71716 | |
| MitoPQ | Abcam | ab146819 | |
| MitoTempo | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| 富马酸二甲酯 | Sigma-Aldrich | 242926 | |
| 4-辛基衣康酸 | Cayman Chemical Company | 3133-16-2 | |
| ML228 | Tocris Bioscience | 4565 | |
| 去铁胺 | Sigma-Aldrich | D9533-1G | |
| 草氨酸钠 | Sigma-Aldrich | 02751 | |
| AR-C 141990盐酸盐 | Tocris | 5658 | |
| AZD3965 | MedChem Express | HY-12750 | |
| 缺氧处理 | 低氧培养箱 | STEMCELL Technologies | 27310 |
| RNA分离 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Life Technologies | 4368813 | |
| Taqman Fast Universal PCR预混液 | Life Technologies | 4367846 | |
| 蛋白质检测 | 抗HIF-1α抗体（Alexa Fluor 488） | Bioss Antibodies | BS-0737R-A488 |
| 免疫荧光 | 抗CD11c抗体（Pacific Blue） | Biolegend | 117321 |
| 抗HIF-1α抗体（山羊） | R&D Systems | AF1935-SP | |
| 抗NDUFA4L2抗体 | Proteintech | 16480-1-AP | |
| 抗sXBP1抗体 | Biolegend | 647502 | |
| 流式细胞术 | Ficoll-Paque PLUS密度梯度介质 | Sigma-Aldrich | GE17-1440-03 |
| Symphony A5流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XFe96分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| MitoSOX线粒体指示剂 | Thermo Fisher Scientific | M36008 | |
| 2-NBDG（荧光葡萄糖类似物） | Thermo Fisher Scientific | N13195 | |
| 均匀标记的13C-乳酸 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1579-N-0.1MG | |
| ChIP | ChIP-IT Express酶剪切和ChIP试剂盒 | Active Motif | 53009 |
| 抗XBP1抗体（小鼠） | Santa Cruz Biotechnology | SC-8015 | |
| IgG1同种型对照 | Abcam | ab171870 | |
| siRNA转染 | Interferin转染试剂 | Polyplus-transfection | 409-10 |
| Opti-MEM培养基 | Life Technologies | 31985062 | |
| Accell人HIF1A-siRNA smart pool | Dharmacon | E-004018-00-0005 | |
| 报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| Gaussia荧光素酶快速检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 16159 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| CD45磁珠分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Pan-DC富集试剂盒 | Miltenyi | 130-100-777 | |
| Costar低吸附96孔板 | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| ELISA | ELISA试剂盒（GM-CSF、IL-10、IFNγ、IL-17A） | Invitrogen/BD Biosciences | -- |
| TMB底物溶液 | Invitrogen | 00-4201-56 | |
| GloMax Explorer多功能酶标仪 | Promega | -- | |
| 乳酸定量 | D-乳酸检测试剂盒 | Abcam | ab174096 |
| L-乳酸检测试剂盒 | Biomedical Research, Service and Clinical Application | A-108 | |
| 细菌构建 | 大肠杆菌Nissle 1917 | DSMZ | DSM 6601 |
| QIAamp Fast DNA粪便微型试剂盒 | Qiagen | 51604 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7645S | |
| NextSeq550高通量测序仪 | Illumina | -- | |
| BioFlow 115生物反应器 | Eppendorf | -- | |
| Ultra-Yield摇瓶 | Thomson | -- | |
| BioPhotometer Plus分光光度计 | Eppendorf | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAE诱导 | MOG35-55剂量、CFA成分、Pertussis toxin剂量和给药时间 阅读提示：Methods: EAE |
| BMDC分化 | GM-CSF浓度、分化天数、培养基成分 阅读提示：Methods: BMDC differentiation |
| DC刺激 | LPS浓度、乳酸浓度和立体异构体、处理时间 阅读提示：Methods: DC stimulation; Figure legends 1j-m |
| 基因敲低/过表达 | siRNA靶基因、转染试剂、转染时间、质粒类型 阅读提示：Methods: Knockdown with siRNA; luciferase assay |
| 代谢分析 | Seahorse实验细胞数、药物处理顺序和浓度（oligomycin, FCCP, Rot/AA） 阅读提示：Methods: OCR; ECAR |
| 体内益生菌治疗 | EcNLac或EcN的给药途径、频率（每日或每周）、剂量、开始时间 阅读提示：Methods: D-LA production kinetics; Figure 4f |