损伤诱导蛋白质合成检测
验证美西螈和小鼠在截肢后蛋白质合成的变化，探究蛋白质合成激活是否特异性存在于再生性损伤。
使用蔗糖密度梯度离心分离多聚体，比较截肢后0 hpa和24 hpa的多聚体谱图；使用OPP标记新生蛋白质，检测断肢组织切片中的蛋白质合成。
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进化上分化的mTOR重塑翻译组以促进组织再生
Evolutionarily divergent mTOR remodels translatome for tissue regeneration
实验完整度
高该研究结合体外细胞模型、动物模型和组学方法，包括多聚体测序、Western blot、药物抑制、细胞活性实验等，进行了功能验证和机制验证。
主要模型
美西螈（Axolotl）肢体再生模型 小鼠（CD1）指截肢模型 HEK293T细胞系及HEK293TaxmTOR稳定细胞系
重点核对
多聚体测序中，0 hpa与24 hpa时间点的生物重复数（n=2）及组织来源（5只野生型亚成体混合） mTOR活性检测中，P-RPS6Ser235/236和P-RPS6Ser240/244在0、2、12、24 hpa的Western blot数据（n=3及以上） 药物处理：INK128（125 mg/kg腹腔注射）、4EGI-1（125或260-290 mg/kg）、Rapamycin（10 μM浸泡）、V-9302（126 mg/kg）的剂量与给药方式 细胞实验：HEK293TaxmTOR细胞在氨基酸剥夺与刺激条件下的处理时间（50分钟饥饿、30分钟刺激） H2DCFDA检测活性氧（ROS）时，用药浓度（5 μM）和成像时间点（36 hpa）
摘要
生物学中一个突出的谜团是，为什么有些物种（如美西螈）能够再生组织，而哺乳动物却不能。在这里，我们证明蛋白质合成的快速激活是美西螈（A. mexicanum）肢体再生所必需的损伤反应的独特特征。通过应用多聚体测序，我们鉴定了数百个转录本，包括抗氧化剂和核糖体组分，这些转录本在损伤反应中从预先存在的mRNA在翻译水平被选择性激活。相比之下，在小鼠中，非再生性指截肢后蛋白质合成并未被激活。我们确定了mTORC1通路是介导美西螈再生性翻译的关键上游信号。令人惊讶的是，我们在有尾两栖动物中发现了mTOR蛋白序列的独特扩展。通过在人细胞中工程化表达美西螈mTOR（axmTOR），我们表明这些变化产生了一种超敏激酶，使美西螈能够将该通路维持在高度不稳定状态，为快速激活做好准备。重要的是，这种变化使美西螈mTOR对营养感知更加敏感。支持这一观点的是，抑制氨基酸转运足以抑制组织再生。总之，这些发现强调了翻译组在高度再生物种中协调伤口愈合早期步骤的意外影响，并为我们理解脊椎动物再生潜力提供了缺失的一环。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 为什么美西螈能够再生肢体而哺乳动物不能？再生性损伤反应是否涉及转录后水平的调控？
- 核心机制
- 美西螈mTOR蛋白含有两个特有的插入序列（插入1和插入2），使其成为对营养水平高度敏感的超敏激酶，能够快速激活mTORC1信号通路，进而促进翻译组重塑和早期伤口愈合。
- 主要证据
- 多聚体测序显示损伤后选择性翻译预先存在的mRNA；Western blot显示mTORC1通路在损伤后快速激活；药物抑制mTOR（INK128、Rapamycin）或翻译起始（4EGI-1）均抑制伤口愈合；HEK293TaxmTOR细胞实验证明插入序列赋予mTOR超敏性；V-9302抑制氨基酸转运也阻碍伤口愈合。
- 研究意义
- 该研究揭示了翻译组在高度再生物种中协调伤口愈合早期步骤的重要作用，并表明通过工程化类似美西螈的mTOR活性或许能够在哺乳动物中促进伤口愈合甚至组织再生，而不会触发致癌转化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多聚体测序鉴定翻译激活的转录本
鉴定美西螈截肢后翻译效率升高的转录本，确定被选择性翻译的mRNA类型及其功能。
开发美西螈特异性多聚体测序流程，对0 hpa和24 hpa的断肢组织进行蔗糖梯度分馏，收集自由/RNP、轻多聚体和重多聚体组分并进行RNA-seq，分析翻译效率变化。
mTORC1信号通路激活验证
验证mTORC1信号通路在美西螈截肢后是否快速激活，并确定其是否介导损伤诱导的翻译激活。
通过Western blot检测P-RPS6Ser235/236、P-RPS6Ser240/244和P-4EBP1Thr37/46等标志物的磷酸化水平；使用mTOR抑制剂INK128处理美西螈，观察对磷酸化和翻译的影响。
mTOR抑制对伤口愈合和再生的影响
评估mTORC1信号在伤口闭合和肢体再生中的必要性。
使用INK128（ATP竞争性mTOR抑制剂）、Rapamycin和4EGI-1（翻译起始抑制剂）处理美西螈，观察伤口闭合、细胞迁移、活性氧（ROS）水平以及长期再生效果。
美西螈mTOR蛋白功能研究
确定美西螈mTOR蛋白中的两个独特插入序列是否赋予其超敏激酶特性，并导致营养敏感性和溶酶体定位的改变。
使用CRISPR/Cas9将美西螈mTOR的插入序列工程化到人HEK293T细胞中，生成HEK293TaxmTOR细胞系；进行氨基酸滴定、饥饿-刺激实验、细胞活力测定和RHEB共免疫沉淀等，评估激酶活性、营养敏感性、RHEB结合等。
氨基酸转运在再生中的作用验证
验证损伤部位释放的氨基酸是否为mTOR激活和伤口愈合所必需。
使用ASCT2抑制剂V-9302处理美西螈，观察其对伤口愈合的影响，并检测损伤后氨基酸转运体mRNA水平的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
分析基因表达
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质合成检测 | O-炔丙基嘌呤霉素 | Medchem Source LLP | JA-1024 |
| 多聚体测序 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| ERCC RNA加标混合物 | Invitrogen | 4456740 | |
| TURBO DNase | Ambion | AM2238 | |
| TruSeq链特异性总RNA文库制备试剂盒（含Ribo-Zero Gold） | Illumina | -- | |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| cOmplete Mini EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PVDF膜 | Biorad | 170-4273 | |
| Clarity Western ECL底物 | Biorad | 170-5061 | |
| SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Fisher | 34095 | |
| 药物处理 | INK128 (MLN0128) | LC Laboratories | I-3344 |
| 雷帕霉素 | LC Chemicals | R-5000 | |
| 4EGI-1 | -- | -- | |
| V-9302 | -- | -- | |
| 夹竹桃麻素（APO） | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| ROS检测 | 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Biotium | 10058 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965-118 |
| 胎牛血清 | Millipore | TMS-013-B | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 5140163 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂盒 | Invitrogen | L3000001 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce Protein G磁珠 | ThermoFisher | 88847 |
| CHAPS去垢剂 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9241 |
| 多聚体谱分析 | RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | 10777019 |
| SuperaseIn RNase抑制剂 | Ambion | AM2696 | |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 78442 | |
| Turbo DNase | Thermo Fisher | AM2238 | |
| RNasin核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2611 | |
| 肝素 | -- | -- | |
| GlycoBlue共沉淀剂 | -- | -- | |
| 超纯无DNase/RNase蒸馏水 | Invitrogen | 10977-015 | |
| TRIzol LS试剂 | Invitrogen | 10296010 | |
| 糖原 | Roche | 10901393001 | |
| 高效cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 436884 | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25917 | |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒（用于测序） | Invitrogen | 450031 | |
| PX459载体 | Addgene | 62988 | |
| 细胞培养/多聚体谱分析 | Opti-MEM培养基 | Invitrogen | 31985070 |
| HBSS缓冲液 | Gibco | 14175-079 | |
| Western blot | Bioruptor超声破碎系统 | Diagenode | -- |
| GloMax-Multi多功能酶标仪 | Promega | E7081 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Biorad | -- | |
| 免疫荧光 | 蔡司Axio Observer Z1显微镜 | Zeiss | -- |
| Perkin Elmer UltraVIEW Vox转盘共聚焦显微镜系统 | Perkin Elmer | -- | |
| 尼康TiE转盘共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 蔡司LSM780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Volocity图像采集软件 | Perkin Elmer | -- | |
| ImageJ图像分析软件 | -- | -- | |
| 细胞角蛋白5/6/18抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53262 | |
| 肌球蛋白重链抗体（MF-20） | DSHB | -- | |
| mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983S | |
| Rab7抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271608 | |
| TXN抗体 | Aviva | ARP72618 | |
| ANXA1抗体 | Proteintech | 21990-1-AP | |
| 磷酸化RPS6 Ser240/244抗体 | Cell Signaling Technology | 5364S | |
| 磷酸化组蛋白H3抗体 | Sigma-Aldrich | 06-570 | |
| Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568二抗 | Thermo Fisher | A-11017 or A10037 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Click-iT Alexa Fluor Picolyl叠氮化物试剂盒 | Thermo Fisher | C10641 or C10642 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lysotracker Red DND-99溶酶体探针 | Invitrogen | L7528 | |
| 纤连蛋白 | Millipore-Sigma | F1141-1MG | |
| Western blot | RPS6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217S |
| 4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9644S | |
| RHEB抗体 | Cell Signaling Technology | 13879S | |
| RAPTOR抗体 | Sigma-Aldrich | 09-217 | |
| Rpl19抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-100830 | |
| Rpl7a抗体 | Cell Signaling Technology | 2415S | |
| SELENBP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-373726 | |
| PRDX1抗体 | Cell Signaling Technology | 8499S | |
| AGR2抗体 | Sigma | AV42290-100UL | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质合成检测 | 多聚体谱图分析的生物重复数：美西螈n=5个独立组织池，小鼠n=3；OPP注射剂量：0.49553 mg/20 g体重 阅读提示：Methods: OPP Incorporation and Immunofluorescent Staining; Sucrose Gradient Fractionation |
| 多聚体测序 | 组织来源：野生型亚成体，每个时间点5只；生物重复n=2；ERCC加标和归一化方法 阅读提示：Methods: Library preparation for Polysome Sequencing; Analysis of Polysome Sequencing Data |
| mTOR信号通路检测 | Western blot检测的磷酸化位点：P-RPS6Ser235/236, Ser240/244, P-4EBP1Thr37/46；时间点：0,2,12,24hpa；每个时间点动物数≥3 阅读提示：Methods: Western blot analysis of protein expression; Results section 'Amputation activates mTOR signaling' |
| 药物处理实验 | INK128剂量：125 mg/kg腹腔注射或10 μM浸泡；Rapamycin浓度：10 μM或5 μM浸泡；4EGI-1剂量：125 mg/kg或260-290 mg/kg；给药时间：截肢前4小时 阅读提示：Methods: Drug administration studies; Figure legends for Fig. 3 and Fig. 4 |
| 细胞实验 | HEK293TaxmTOR细胞系构建：CRISPR/Cas9插入两个axolotl插入序列；饥饿条件：50分钟无氨基酸、葡萄糖、血清；刺激条件：不同浓度氨基酸、葡萄糖、FBS处理30分钟 阅读提示：Methods: Generation of chimeric human-axolotl mTOR kinase in HEK293T cells; Characterizing the function of chimeric axmTOR |