数据获取与预处理
获取不同细胞状态下的分子数据，为后续分析准备输入。
对SH-SY5Y TrkA/TrkB细胞使用RPPA测量115种蛋白的磷酸化或丰度，并进行标准化；对SKMEL-133细胞使用已发表的RPPA数据；对EMT数据使用scRNA-seq和CyTOF数据。
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控制细胞状态转变
Control of cell state transitions
实验完整度
高包含体外细胞系实验（SH-SY5Y、SKMEL-133）、多种组学数据（RPPA、MS、RNA-seq、CyTOF）、药物扰动和功能验证（分化表型）以及机制模型验证。
主要模型
SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（表达TrkA或TrkB） SKMEL-133黑色素瘤细胞系（RAF抑制剂耐药） A549、DU145、MCF7、OVCA420细胞系（scRNA-seq EMT数据） Py2T乳腺癌细胞系（CyTOF EMT数据）
重点核对
SH-SY5Y细胞分别用100 ng/ml NGF或BDNF刺激。 TrkA和TrkB细胞的刺激时间点为10和45分钟。 使用的抑制剂浓度：SP600125 (5 μM)、AKT inhibitor IV (1 μM)、JNK-IN-8 (1 μM)、LY2584702 (1 μM)、Trametinib (0.5 μM)、BI-D1870 (1 μM)、Gefitinib (2.5或5 μM)。 分化评估在72小时进行，以神经突长度≥2倍细胞体直径为标准。 使用3个生物学重复。
摘要
理解细胞状态转变并有目的地控制它们一直是生物学中的一个长期挑战。在这里，我们提出了细胞状态转变评估与调控（cSTAR），这是一种绘制细胞状态图谱、对细胞状态间的转变进行建模，并预测将细胞命运决定转化为目标干预措施的方法。cSTAR以组学数据作为输入，对细胞状态进行分类，并开发了一个工作流，将输入数据转化为机制模型，该模型识别一个核心信号网络，该网络通过影响全细胞网络来控制细胞命运转变。通过整合信号和表型数据，cSTAR模拟细胞如何在Waddington景观中移动并决定采用哪种细胞命运。重要的是，cSTAR设计了干预措施来控制细胞在Waddington景观中的移动。在细胞分化与增殖模型中测试cSTAR显示，定量预测与实验数据之间具有高度相关性。将cSTAR应用于不同类型的扰动和组学数据集（包括单细胞数据）证明了其灵活性和可扩展性，并提供了新的生物学见解。cSTAR识别能够相互转化细胞命运的有针对性扰动的能力，将有助于设计操纵细胞发育途径和基于机制的干预治疗的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何基于组学数据构建机制模型，识别控制细胞状态转变的核心信号网络，并预测能够将一种细胞状态转化为另一种状态的靶向干预。
- 核心机制
- 核心信号网络中的正反馈环路（如TrkB网络中的ERBB->ERK->RSK->ERBB）和非线性信号动态决定细胞命运；DPD模块输出（S）表示细胞表型沿STV方向的移动距离，其符号决定分化（负）或增殖（正）。
- 主要证据
- 在SH-SY5Y TrkA/TrkB细胞中，RPPA数据和Western blot验证了模型预测的信号动态；抑制剂扰动（如S6K抑制）改变DPD并诱导分化；通过表达myristoylated AKT实现模拟预测（将分化转为增殖）。
- 研究意义
- cSTAR提供了一种细胞特异性的机制方法，可描述、理解并有意操纵细胞命运决定，在开发设计性细胞命运转换和基于机制的干预治疗方面具有应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞状态分类与分离
区分不同细胞状态并确定状态间边界。
使用K-means和Ward层次聚类对RPPA数据进行聚类，然后使用线性核SVM构建最大间隔超平面，以分离不同细胞状态的数据点。
构建状态转变向量（STV）
确定从一种状态转变为另一种状态所需的分子变化方向。
计算两个状态质心之间的连接向量，并归一化为单位长度的STV，其分量表示各蛋白对状态转变的贡献。
扰动与动态表型描述符（DPD）计算
评估扰动对细胞表型的影响，并验证STV成分的功能。
用特定抑制剂处理细胞，测量扰动前后质心位置变化，计算DPD值变化（ΔS），并与实验观察到的表型变化关联。
核心网络重建（BMRA）
重建核心信号网络的拓扑结构和连接强度，并量化各模块对DPD的影响。
使用药物扰动数据，基于贝叶斯模块响应分析（BMRA）推断网络连接系数（rij），并确定各信号模块到DPD模块的连接系数。
构建非线性动态模型
使用机制模型预测信号动态和细胞状态转变。
根据BMRA推断的网络构建ODE模型，描述蛋白质磷酸化和DPD动态，并通过拟合训练数据（Western blot和10分钟RPPA数据）优化参数。
模型预测与实验验证
验证模型预测的细胞状态转变和药物组合效应。
模拟预测不同抑制剂和组合对DPD的影响，并通过成像和Western blot在实验中进行验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 转染 | JetPrime转染试剂 | Polypus | -- |
| 药物处理 | SP600125 | Selleckchem | S1460 |
| JNK-IN-8 | Selleckchem | S4901 | |
| AKT抑制剂IV | Merck Millipore | 124011 | |
| LY2584702 | Selleckchem | S7698 | |
| 曲美替尼 | Selleckchem | GSK1120212 | |
| BI-D1870 | Selleckchem | S2843 | |
| 吉非替尼 | Selleckchem | ZD-1839 | |
| 刺激 | 神经生长因子（重组） | Peprotech | 450-01 |
| 脑源性神经营养因子（重组） | Peprotech | 450-02 | |
| 抗体 | 抗磷酸化TrkA/TrkB抗体 | Cell Signaling Technology | 4621 |
| 抗总TrkA抗体 | Cell Signaling Technology | 2505 | |
| 抗总TrkB抗体 | Cell Signaling Technology | 4603 | |
| 抗磷酸化FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 8556 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗兔IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗鼠IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Sigma-Aldrich | 8159 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Sigma-Aldrich | 5670 | |
| 抗FAK抗体 | Santa Cruz | sc-558 | |
| 抗V5-HRP抗体 | Life Technologies | R961-25 | |
| 质粒构建 | pLX302/NTRK1表达载体 | Addgene | 23891 |
| pLX302/NTRK2表达载体 | Addgene | 23883 | |
| pLX302目的载体 | Addgene | 25896 | |
| 转染 | Gateway克隆系统 | Life Technologies | -- |
| 细胞裂解 | NP-40 | Calbiochem | -- |
| COMPLETE Mini蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| SDS-PAGE电泳系统 | Bio-Rad | Mini | |
| 增强化学发光系统 | GE Healthcare | -- | |
| ChemoStar成像仪 | INTAS Science Imaging Instruments GmbH | -- | |
| Image J软件 | -- | -- | |
| 增殖分析 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| SpectraMax M3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution细胞增殖检测试剂盒 | Promega | -- | |
| Nunc F96微孔板（白色聚苯乙烯） | Thermo Scientific | 136101 | |
| 96孔F底组织培养板 | Greiner | 655180 | |
| RPPA | 硝酸纤维素包被玻片 | Grace Bio-Labs | -- |
| Aushon 2470芯片点样仪 | Quanterix | -- | |
| SuperBlock (TBS)封闭液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DyLight 800偶联二抗 | New England BioLabs | -- | |
| InnoScan 710-IR扫描仪 | Innopsys | -- | |
| Mapix软件 | Innopsys | -- | |
| 质谱 | 尿素 | -- | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 甲酸 | -- | -- | |
| HyperSep SpinTip P-20 | Thermo Scientific | -- | |
| Titansphere Phos-TiO 10 μm | GL Sciences Inc | -- | |
| 2,5-二羟基苯甲酸 | -- | -- | |
| 氢氧化铵 | -- | -- | |
| Bruker timsTof Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| Evosep One液相色谱系统 | Evosep | -- | |
| Maxquant软件 | -- | -- | |
| 成像 | EVOS FL成像系统 | Life Technologies | -- |
| RPPA裂解 | Coomassie Plus蛋白定量试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 裂解 | Triton X-100 | -- | -- |
| HEPES | -- | -- | |
| 氯化钠 | -- | -- | |
| 氯化镁 | -- | -- | |
| EGTA | -- | -- | |
| 焦磷酸钠 | -- | -- | |
| 钒酸钠 | -- | -- | |
| 甘油 | -- | -- | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| 分析 | Pandas库 | -- | -- |
| scikit-learn库 | -- | -- | |
| R基础函数 | -- | -- | |
| pheatmap R包 | -- | -- | |
| 建模 | BioNetGen软件 | -- | -- |
| SUNDIALS | -- | -- | |
| Matplotlib | -- | -- | |
| pyBioNetFit | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与细胞系生成 | SH-SY5Y细胞培养条件：RPMI 1640 + 10% FBS + 2 mM L-谷氨酰胺 + 1% 青霉素-链霉素，5% CO2；转染使用JetPrime；筛选使用2 μg/ml嘌呤霉素2周。 阅读提示：Methods: Generation of isogenic cell lines |
| 配体刺激 | 配体浓度：100 ng/mL NGF或BDNF；刺激时间点：10和45分钟（RPPA）和72小时（分化评估）。 阅读提示：Methods: Stimulation of TrkA and TrkB-expressing SH-SY5Y cells |
| 抑制剂处理 | 抑制剂种类和浓度：SP600125 (5 μM)，AKT inhibitor IV (1 μM)，JNK-IN-8 (1 μM)，LY2584702 (1 μM)，Trametinib (0.5 μM)，BI-D1870 (1 μM)，Gefitinib (2.5或5 μM)。 阅读提示：Extended Data Figure 1 和图例 |
| RPPA检测 | 定制RPPA包含115种抗体；细胞裂解液制备和标准化流程；数据标准化按GAPDH和无刺激对照计算倍数变化。 阅读提示：Methods: Reverse Phase Protein Array (RPPA) |
| Western blot | 细胞裂解缓冲液成分：10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40；离心条件：10,000g, 10 min, 4°C；蛋白定量使用BCA。 阅读提示：Methods: Western Blotting |
| 分化表型评估 | 分化定义：神经突长度≥2倍细胞体直径；评估时间点：72小时；使用EVOS FL成像系统；每个条件3个生物学重复。 阅读提示：Methods: Imaging experiments and drug interaction calculations |
| 质谱分析 | 蛋白质消化条件：尿素浓度降至2M，胰蛋白酶1:100，37°C过夜；磷酸化富集用TiO2；LC-MS/MS使用Bruker timsTof Pro。 阅读提示：Methods: Sample Preparation for Mass Spectrometry Experiments 和 LC/MSMS Method |