TDP-43丝的提取与鉴定
从A型FTLD-TDP患者脑组织中提取并确认TDP-43丝的存在。
使用sarkosyl提取方法从患者前额叶皮层中提取不溶性TDP-43，并通过免疫印迹和免疫金负染确认其身份和磷酸化状态。
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TDP-43在A型FTLD-TDP中形成具有独特折叠的淀粉样丝
TDP-43 forms amyloid filaments with a distinct fold in type A FTLD-TDP
实验完整度
高包括患者脑组织提取、免疫组化、免疫印迹、质谱分析、冷冻电镜结构解析及原子模型构建等多个证据层级，并包含功能验证（翻译后修饰对丝形成的影响）。
主要模型
A型FTLD-TDP患者前额叶皮层脑组织 TDP-43淀粉样丝
重点核对
患者是否存在GRN突变 TDP-43提取方法中的离心速度（27,000g vs 21,000g） 冷冻电镜数据采集的显微镜型号和探测器 R293的翻译后修饰类型（瓜氨酸化或单甲基化）
摘要
TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）在神经元和胶质细胞中的异常组装是几乎所有肌萎缩侧索硬化症（ALS）病例和约一半的额颞叶变性（FTLD）病例的特征。TDP-43组装在神经退行性变中的因果作用由TARDBP（编码TDP-43的基因）中显性遗传的错义突变所证明，这些突变促进组装并导致ALS和FTLD。至少四种类型（A-D）的FTLD伴TDP-43病理（FTLD-TDP）由组装TDP-43的不同脑分布定义，并与额颞叶痴呆的不同临床表现相关。我们此前使用冷冻电镜表明，TDP-43在ALS和B型FTLD-TDP中组装成淀粉样丝。然而，在没有ALS的FTLD中组装TDP-43的结构仍然未知。在这里，我们报告了来自三名最常见FTLD-TDP类型（A型）个体的脑中组装TDP-43的冷冻电镜结构。TDP-43形成了具有新折叠的淀粉样丝，该折叠在个体间相同，表明该折叠可能是A型FTLD-TDP的特征。该折叠类似于雪佛龙徽章，不同于ALS和B型FTLD-TDP的双螺旋形折叠，确立了TDP-43的不同丝状折叠表征不同的神经退行性疾病。这些结构与质谱法相结合，鉴定了组装TDP-43的两种新翻译后修饰：R293的瓜氨酸化和单甲基化，并表明它们可能促进丝的形成和观察到的单个丝的结构变异。来自A型FTLD-TDP的TDP-43丝结构将指导TDP-43组装的机制研究，以及TDP-43蛋白病诊断和治疗化合物的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- A型FTLD-TDP中TDP-43是否形成淀粉样丝？其结构与ALS和B型FTLD-TDP中的TDP-43丝有何不同？
- 核心机制
- A型FTLD-TDP中TDP-43形成具有雪佛龙折叠的淀粉样丝，该折叠与ALS和B型FTLD-TDP的双螺旋折叠不同，R293的瓜氨酸化和单甲基化可能影响丝的形成和结构变异。
- 主要证据
- 通过冷冻电镜解析了来自三名A型FTLD-TDP患者（其中两名携带GRN突变，一名野生型）前额叶皮层中提取的TDP-43丝的结构，分辨率高达2.4 Å，并通过质谱鉴定了R293的翻译后修饰。
- 研究意义
- 该结构将指导TDP-43组装的机制研究，以及TDP-43蛋白病诊断和治疗化合物的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜数据采集与结构解析
确定TDP-43丝的原子结构，并比较不同个体之间的结构差异。
使用冷冻电镜对提取的TDP-43丝进行成像，并通过螺旋重构确定其原子模型。
质谱分析翻译后修饰
鉴定TDP-43丝上的翻译后修饰，特别是R293的修饰。
对提取的TDP-43丝进行蛋白酶消化，然后进行LC-MS/MS分析，鉴定肽段和翻译后修饰。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织学 | SureSelectXT人类全外显子试剂盒 | Agilent | V6, 58 megabase pairs |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| 蛋白质提取 | Polytron匀浆机 | Kinematica | -- |
| Qsonica Q700超声破碎仪 | Qsonica | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗TDP-43 N端抗体（ab57105） | Abcam | ab57105 |
| 抗TDP-43 N端抗体（10782-2-AP） | Proteintech | 10782-2-AP | |
| 抗pS409/410 TDP-43抗体（CAC-TIP-PTD-M01） | CosmoBio | CAC-TIP-PTD-M01 | |
| ABC染色试剂盒 | Vector | -- | |
| 免疫印迹 | Novex BIS-Tris凝胶 | Novex | -- |
| StarBright Blue 520荧光染料 | Bio-Rad | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫金负染 | Tecnai Spirit透射电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| JEM-1400透射电镜 | JEOL | -- | |
| 质谱 | 链霉蛋白酶 | Sigma | -- |
| 二硫苏糖醇 | -- | 3483-12-3 | |
| 胰凝乳蛋白酶 | Promega | -- | |
| C18 STAGE tips | 3M Empore | -- | |
| 多孔低聚R3树脂 | Thermo Fisher | -- | |
| Ultimate 3000 RSLCnano系统 | Thermo Fisher | -- | |
| PepMap 100 C18纳升捕集柱 | Thermo Scientific | -- | |
| nanoEase M/Z HSS C18 T3色谱柱 | Waters | -- | |
| Orbitrap Eclipse质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil 1.2/1.3微孔碳支持膜铜网 | Quantifoil | -- |
| Vitrobot Mark IV快速冷冻仪 | Thermo Fisher | -- | |
| Titan Krios显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| K3探测器 | Gatan | -- | |
| GIF Quantum能量过滤器 | Gatan | -- | |
| EPU软件 | Thermo Fisher | -- | |
| 结构分析 | COOT | -- | -- |
| ISOLDE | -- | -- | |
| REFMAC5 | -- | -- | |
| Relion-4.0 | -- | -- | |
| Servalcat | -- | -- | |
| MolProbity | -- | -- | |
| ChimeraX | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TDP-43丝提取 | 脑组织样本来源（如脑库）、提取缓冲液配方、sarkosyl浓度、离心速度（27,000g或21,000g）、温度等 阅读提示：Methods: Extraction of pathological assembled TDP-43 |
| 冷冻电镜数据采集 | 显微镜型号、加速电压、探测器、能量过滤器、像素大小、总剂量、缺陷范围 阅读提示：Methods: Cryo-EM 和 Extended Data Table 2 |
| 结构解析 | 螺旋重构软件（RELION）、3D分类、对称性、分辨率等 阅读提示：Methods: Helical reconstruction |
| 质谱分析 | 蛋白酶、消化的时间温度、色谱柱、质谱仪、数据搜库参数等 阅读提示：Methods: Mass spectrometry |
| 翻译后修饰鉴定 | R293的修饰类型（瓜氨酸化或单甲基化） 阅读提示：Results: Post-translational modification of R293 |