热蛋白组学筛选
鉴定乳酸直接影响的蛋白质
在HEK细胞裂解液中添加乳酸，进行热梯度处理，通过质谱分析蛋白质热稳定性变化。
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乳酸通过重塑后期促进复合物调节细胞周期
Lactate regulates cell cycle by remodelling the anaphase promoting complex
实验完整度
高包含体外热稳定性分析、IP-MS、细胞实验、基因敲除/突变、重组蛋白活性、NMR结构解析和动物细胞验证等多层级实验。
主要模型
HEK细胞裂解液 HeLa S3细胞 HCT116细胞 DLD1细胞 小鼠原代CD8+ T细胞
重点核对
乳酸浓度：15 mM和25 mM APC4 SUMO化位点K772和K798 SENP1活性位点锌结合 细胞同步方法：胸苷-诺考达唑或双胸苷阻断 免疫沉淀使用CDC27抗体
摘要
乳酸在快速分裂细胞中含量丰富，因为增殖需要升高的葡萄糖分解代谢1-6。然而，尚不清楚积累的乳酸是否影响增殖状态。在这里，我们采用系统方法来确定乳酸依赖性的人类蛋白质组蛋白质调节。从这些数据中，我们阐明了细胞周期调节机制，其中积累的乳酸重塑后期促进复合物（APC/C）。这种重塑是由乳酸直接抑制SUMO蛋白酶SENP1引起的。我们发现积累的乳酸通过与SENP1活性位点中的锌形成复合物来结合并抑制SENP1。乳酸抑制SENP1稳定了APC4上两个残基的SUMO化，这驱动了UBE2C与APC/C的结合。乳酸对APC/C的这种直接调节刺激了细胞周期蛋白的定时降解和增殖人类细胞的有效有丝分裂退出。上述机制在有丝分裂进入时乳酸丰度达到顶峰时启动。通过这种方式，乳酸的积累传达了营养充足的生长期后果，以刺激APC/C的定时开放、细胞分裂和增殖。相反，乳酸的持续积累驱动异常的APC/C重塑，并可通过有丝分裂滑移克服抗有丝分裂药理学。总之，我们定义了一种生化机制，通过该机制乳酸直接调节蛋白质功能以控制细胞周期和增殖。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 积累的乳酸是否直接影响细胞周期和增殖的进程？
- 核心机制
- 乳酸通过与SENP1活性位点中的锌形成复合物抑制SENP1，稳定APC4的K772和K798残基SUMO化，促进APC/C构象重塑以结合UBE2C，从而增强细胞周期蛋白的降解和有丝分裂退出。
- 主要证据
- 通过热蛋白组学（TPP）鉴定，IP-MS显示乳酸促进UBE2C、Cyclin B1和Securin与APC/C结合，基因突变和敲除验证APC4 SUMO化位点及SENP1的关键作用。
- 研究意义
- 揭示乳酸作为代谢产物直接调节蛋白质功能和细胞周期的机制，提示乳酸在生理和病理条件下（如肿瘤）可能的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
APC/C相互作用验证
验证乳酸是否调节APC/C与UBE2C等蛋白的结合
在前期同步的前中期细胞裂解液中，添加乳酸后进行APC/C免疫沉淀，检测UBE2C、Cyclin B1、Securin及CDK1/2的结合。
SUMO化修饰分析
检测乳酸是否影响APC4的SUMO化
通过免疫沉淀APC/C或APC4后进行SUMO2/3免疫印迹，并用质谱鉴定SUMO化位点。
SENP1机制研究
确定乳酸抑制SENP1的结构基础
通过NMR、质谱和酶活性实验分析乳酸和锌对SENP1的结合与抑制。
细胞周期和有丝分裂实验
验证乳酸积累是否影响细胞周期进程
通过同步化细胞监测细胞内乳酸水平、Cyclin B1/Securin降解和有丝分裂时间。
增殖和微环境实验
评估乳酸对细胞增殖和耐药的潜在影响
测定野生型和APC4 K772/798R细胞的增殖率，并检测乳酸升高时对微管抑制剂耐药的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白热稳定性分析
蛋白质结构分析
代谢物分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-017-CV |
| 胎牛血清 | GeminiBio | 100-106 | |
| 青霉素/链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-056 | |
| 细胞同步化 | 胸苷 | Sigma | T1895 |
| 诺考达唑 | Sigma | M1404 | |
| 细胞处理 | 乳酸钠 | Sigma | L7022 |
| 乳酸 | Sigma | L1750 | |
| D-乳酸钠 | Sigma | 71716 | |
| 寡霉素A | Selleck | S1478 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Selleck | S8612 | |
| GSK2837808A | Thermo Fisher Scientific | 518910 | |
| 抗体 | UBE2C抗体 | Abcam | ab252940 |
| Cyclin B1抗体 | CST | #12231 | |
| Securin抗体 | CST | 13445 | |
| SUMO2/3抗体 | Abcam | ab81371 | |
| SUMO1抗体 | PTM BIO | PTM-6055 | |
| SENP1抗体 | Proteintech | 25349-1-AP | |
| CDC27抗体 | Santa Cruz | sc-9972 | |
| APC4抗体 | Bethyl Laboratories | A301-176A | |
| H3抗体 | CST | 4499 | |
| 磷酸化H3S10抗体 | CST | 53348 | |
| PDH抗体 | CST | 3205 | |
| 磷酸化PDH抗体 | CST | 31866 | |
| β-肌动蛋白抗体 | CST | 3700 | |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | Millipore | -- |
| ECL蛋白质印迹底物 | Pierce | 32106 | |
| 抗兔HRP | Promega | W401B | |
| 抗鼠HRP | Promega | W402B | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G磁珠 | Invitrogen | 10007D |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000001 |
| 基因编辑 | PX458载体 | Addgene | 48138 |
| 重组蛋白表达 | Ni-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | -- |
| 质谱 | Orbitrap Eclipse三合一质谱仪 | Thermo | -- |
| Easy-nLC 1200液相色谱 | Thermo | -- | |
| 代谢组学 | Nexera X2超高效液相色谱 | Shimadzu | -- |
| Q Exactive-HF-X轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 热蛋白组学（TPP） | 乳酸浓度（15 mM和25 mM）、处理时间（15分钟）、细胞裂解液蛋白浓度（1 mg/ml） 阅读提示：Methods的Thermal proteomic profiling部分 |
| 细胞同步化 | 胸苷浓度（2 mM）、诺考达唑浓度（100 ng/ml）、处理时间 阅读提示：Methods的Cell synchronization部分 |
| 免疫沉淀（IP） | 抗体（CDC27、APC4、UBE2C）、抗体量（2 μg、1 μg）、孵育时间（过夜）、乳酸浓度（15 mM） 阅读提示：Methods的Immunoprecipitation of APC/C和Immunoprecipitation of UBE2C部分 |
| SUMO化检测 | 乳酸浓度（15 mM）、处理时间（15分钟裂解液或4小时完整细胞）、APC4 SUMO化位点（K772/K798） 阅读提示：Methods的Cell lysate preparation for IP-MS/IP-binding/IP-SUMO2/3 experiments和Figure 2 |
| 有丝分裂时间成像 | 细胞密度（200,000细胞/孔）、药物处理（DCA 25 mM）、成像间隔（5分钟） 阅读提示：Methods的Timelapse microscopy部分 |
| 细胞增殖实验 | 细胞初始密度（HeLa S3 300,000、HCT116 200,000细胞/孔）、计数时间（第1-5天） 阅读提示：Methods的Cellular proliferation assay部分 |