B.1.617谱系的分子进化和流行病学分析
确定B.1.617谱系及其亚谱系的系统发育关系和流行动态，并识别关键突变。
从GISAID数据库下载大量SARS-CoV-2基因组，构建最大似然树，分析各亚谱系的流行比例，并统计S蛋白中的氨基酸替换。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SARS-CoV-2 Delta P681R突变增强膜融合性和致病性
Enhanced fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Delta P681R mutation
实验完整度
高包含分子进化分析、体外细胞感染、合胞体形成、假病毒融合、反向遗传学、仓鼠感染模型及组织病理学等多层级验证，并明确功能与机制验证。
主要模型
叙利亚仓鼠感染模型 VeroE6/TMPRSS2细胞 Calu-3细胞 人原代鼻上皮细胞
重点核对
B.1.617.2/Delta变异株和B.1.1分离株的感染剂量（105 TCID50/100 μl） D614G和D614G/P681R病毒的感染剂量（104 TCID50/30 μl） 刺突蛋白P681R突变对S蛋白切割的影响（Western blot） 融合实验中的ACE2表达和TMPRSS2表达条件 仓鼠肺组织病理评分和CT严重度评分
摘要
在当前新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行期间，严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的病毒基因组中积累了多种突变，截至撰写本文时，有四种关切变异株被认为对人类社会具有潜在危害1。最近出现的B.1.617.2/Delta关切变异株与2021年春季印度COVID-19疫情激增密切相关（参考文献2）。然而，B.1.617.2/Delta的病毒学特性仍不清楚。在此，我们显示B.1.617.2/Delta变异株在感染的仓鼠中具有高膜融合性，并且比原型SARS-CoV-2具有明显更强的致病性。刺突蛋白中的P681R突变在该谱系中高度保守，可促进刺突蛋白的切割并增强病毒膜融合性。此外，我们证明携带P681R的病毒与其亲本病毒相比表现出更高的致病性。我们的数据表明，P681R突变是B.1.617.2/Delta变异株病毒学表型的标志，并与增强的致病性相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- B.1.617.2/Delta变异株的病毒学特性，特别是其感染性和致病性是否较原型病毒增强，以及P681R突变的作用机制。
- 核心机制
- P681R突变位于刺突蛋白弗林蛋白酶切割位点附近，促进S蛋白切割，增强病毒膜融合性（合胞体形成），并导致在仓鼠中增强的致病性。
- 主要证据
- 通过反向遗传学构建携带P681R的病毒，在体外细胞中观察到更大的合胞体和增强的融合速度；在叙利亚仓鼠模型中，P681R病毒导致更显著的体重下降、肺功能损伤和肺组织病理改变。
- 研究意义
- 表明P681R突变是Delta变异株病毒学表型的标志，与增强的致病性相关，提示该突变可能部分解释了Delta变异株引起的更严重的COVID-19症状。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Delta变异株的体外病毒学特征
比较B.1.617.2/Delta变异株与B.1.1分离株的生长动力学和合胞体形成能力。
在Vero、VeroE6/TMPRSS2和Calu-3细胞中感染病毒，通过RT-qPCR测定病毒RNA拷贝数，并通过显微镜观察和测量合胞体大小。
Delta变异株在叙利亚仓鼠中的致病性
评估B.1.617.2/Delta变异株与B.1.1相比在体内的致病性。
叙利亚仓鼠经鼻内接种病毒，监测体重、口腔拭子病毒载量、肺组织病理学、免疫组化和肺功能，并评估CT严重度。
P681R突变对病毒膜融合性的影响
验证P681R突变是否促进S蛋白切割和增强病毒膜融合性。
通过反向遗传学生成携带P681R的病毒，并在体外细胞中比较合胞体形成、细胞-细胞融合、S蛋白切割和融合速度。
P681R突变对中和抗体敏感性的影响
评估P681R突变是否影响病毒对中和抗体的敏感性。
使用HIV-1假病毒携带SARS-CoV-2 S蛋白（D614G或D614G/P681R），进行中和实验，使用单克隆抗体和疫苗接种者血清。
P681R突变在仓鼠中的致病性验证
评估P681R突变对病毒在体内复制和致病性的影响。
叙利亚仓鼠感染D614G或D614G/P681R病毒，监测体重、肺功能、病毒滴度和肺组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基（高糖） | Wako | 044-29765 |
| Eagle最低必需培养基 | Wako | 051-07615 | |
| Dulbecco改良Eagle培养基（低糖） | Wako | 041-29775 | |
| Eagle最低必需培养基 | Sigma-Aldrich | M4655-500ML | |
| Dulbecco改良Eagle培养基（高糖） | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
| G418 | Nacalai Tesque | G8168-10ML | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| 动物实验 | 异氟烷 | Sumitomo Dainippon Pharma | -- |
| 组织病理学 | EnVision FLEX靶向修复液（高pH） | Agilent | K8004 |
| 抗SARS-CoV-2 N单克隆抗体 | R & D systems | MAB10474-SP | |
| EnVision FLEX检测系统 | Agilent | -- | |
| 肺功能检测 | 全身体积描记系统 | PrimeBioscience | -- |
| FinePointe软件 | Data Sciences International | -- | |
| microCT成像 | CosmoScan GXII微CT扫描仪 | Rigaku | -- |
| CosmoScan Database软件 | Rigaku | -- | |
| 病毒分离与测序 | QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | 52906 |
| NEB Next Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolab | E7530 | |
| MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| MiSeq试剂盒v3 | Illumina | MS-102-3001 | |
| 细胞感染实验 | ECLIPSE Ts2显微镜 | Nikon | -- |
| Photoshop 2020 | Adobe | -- | |
| 一体化荧光显微镜BZ-X800 | Keyence | -- | |
| BZ-X800分析软件 | Keyence | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| 免疫荧光 | 兔抗SARS-CoV-2 N多克隆抗体 | GeneTex | GTX135570 |
| Alexa 488偶联的抗兔IgG抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| 空斑实验 | 羧甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | C9481-500G |
| 甲醛中性缓冲溶液 | Nacalai Tesque | 37152-51 | |
| 结晶紫 | Nacalai Tesque | 09804-52 | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 反向遗传学 | PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 | Takara | R050A |
| TransIT-LT1转染试剂 | Takara | MIR2300 | |
| 多西环素 | Takara | 1311N | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| GENEART定点突变系统 | Thermo Fisher Scientific | A13312 | |
| SuperScript III逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18080085 | |
| RT-qPCR | One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR试剂盒 | Takara | RR096A |
| SARS-CoV-2直接检测RT-qPCR试剂盒 | Takara | RC300A | |
| QuantStudio 3实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| CFX Connect实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| Eco实时PCR系统 | Illumina | -- | |
| 7500实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 质粒构建 | pCAGGS载体 | -- | -- |
| 假病毒实验 | psPAX2-IN/HiBiT质粒 | -- | -- |
| pWPI-Luc2质粒 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| PEI Max转染试剂 | Polysciences | 24765-1 | |
| One-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | E6130 | |
| CentroXS3酶标仪 | Berthhold Technologies | -- | |
| GloMax explorer多功能酶标仪3500 | Promega | -- | |
| Western blot | Nonidet P40替代物 | Nacalai Tesque | 18558-54 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Nacalai Tesque | 03969-21 | |
| 蛋白定量染料 | Bio-Rad | 5000006 | |
| NuPAGE LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 小鼠抗SARS-CoV-2 S单克隆抗体（1A9） | GeneTex | GTX632604 | |
| 兔抗ACTB单克隆抗体（13E5） | Cell Signalling | 4970 | |
| 小鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体（183-H12-5C） | NIH HIV Reagent Program | ARP-3537 | |
| HRP偶联的驴抗兔IgG多克隆抗体 | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| HRP偶联的驴抗小鼠IgG多克隆抗体 | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | |
| SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | 34095 | |
| Western BLoT超灵敏HRP底物 | Takara | T7104A | |
| Amersham Imager 600成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| Image Studio Lite软件 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 融合实验 | pDSP1-7质粒 | -- | -- |
| pDSP8-11质粒 | -- | -- | |
| EnduRen活细胞底物 | Promega | E6481 | |
| Centro XS3 LB960酶标仪 | Berthhold Technologies | -- | |
| 兔抗SARS-CoV-2 S单克隆抗体（HL6） | GeneTex | GTX635654 | |
| 兔抗SARS-CoV-2 S S1/S2多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-112048 | |
| 正常兔IgG | SouthernBiotech | 0111-01 | |
| APC偶联的山羊抗兔IgG多克隆抗体 | Jackson ImmunoResearch | 111-136-144 | |
| 流式细胞术 | FACS Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 中和实验 | 8A5中和抗体 | Elabscience | E-AB-V1021 |
| 4A3中和抗体 | Elabscience | E-AB-V1024 | |
| CB6中和抗体 | Elabscience | E-AB-V1028 | |
| Prism 9软件 | GraphPad Software | -- | |
| 统计 | Excel软件 | Microsoft | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒分离和制备 | 病毒分离株的来源（B.1.617.2/Delta和B.1.1）及工作病毒制备的细胞系（VeroE6/TMPRSS2）和培养条件 阅读提示：Methods部分：SARS-CoV-2 preparation and titration |
| 体外感染实验 | 细胞系（Vero、VeroE6/TMPRSS2、Calu-3）的接种密度、感染剂量（如100 TCID50）、时间点（0-72 h.p.i.） 阅读提示：Methods部分：SARS-CoV-2 infection；Figure 2a图例 |
| 合胞体形成实验 | 细胞系（VeroE6/TMPRSS2）、感染时间（72 h.p.i.）、合胞体大小测量方法（Photoshop） 阅读提示：Methods部分：SARS-CoV-2 infection；Figure 2b图例 |
| 仓鼠感染实验 | 叙利亚仓鼠的品系、年龄、性别（4周龄雄性），感染剂量（如10^5 TCID50/100 μl）、接种途径（鼻内）、监测时间（1-7 d.p.i.） 阅读提示：Methods部分：Animal experiments；Figure 2c,d图例 |
| 组织病理学 | 组织固定、切片厚度（3 μm）、染色方案（H&E）、病理评分标准（0-3） 阅读提示：Methods部分：Histopathological analysis，Histopathological scoring of lung lesions |
| 反向遗传学 | CPER方法所需的DNA片段和引物序列、突变引入方法（GENEART）、病毒拯救细胞系（HEK293-C34）和培养条件 阅读提示：Methods部分：SARS-CoV-2 reverse genetics；Supplementary Table 3 |
| 膜融合实验 | 效应细胞和靶细胞的制备（HEK293）、质粒浓度（S表达质粒400 ng，ACE2质粒0-1000 ng，TMPRSS2质粒40 ng）、测量时间点 阅读提示：Methods部分：SARS-CoV-2 S-based fusion assay |
| 中和实验 | 假病毒的制备（pseudovirus）、靶细胞（HOS-ACE2/TMPRSS2）、血清/抗体稀释、孵育时间和温度（37°C，1 h） 阅读提示：Methods部分：Pseudovirus assay，Neutralization assay |