分离和测序抗原特异性B细胞
获得针对SARS-CoV-2 RBD的单克隆抗体序列
从COVID-19康复者、疫苗接种者和SARS-CoV-1康复者并接种疫苗者中分离PBMC，通过FACS分选RBD双阳性B细胞，进行单细胞V(D)J测序。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
奥密克戎逃逸了大多数现有的SARS-CoV-2中和抗体
Omicron escapes the majority of existing SARS-CoV-2 neutralizing antibodies
实验完整度
高包含体外酵母展示突变筛选、假病毒中和实验、ELISA、BLI和结构分析等多个独立证据层级，并有明确的功能和机制验证。
主要模型
SARS-CoV-2 RBD酵母展示突变文库 VSV假病毒系统 Huh-7细胞 人类中和抗体集合（247种）
重点核对
Omicron变异株RBD的15个突变位点 ACE2阳性选择以排除非功能性RBD突变体 MACS筛选使用Protein A磁珠进行两轮阴性选择 假病毒中和实验使用Huh-7细胞，重复两次或三次 抗体分组基于MDS和无监督k-medoids聚类
摘要
SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron)变异株包含15个受体结合域(RBD)的突变。Omicron如何逃逸RBD靶向的中和抗体需要立即研究。在这里，我们使用高通量酵母展示筛选来确定247种人抗RBD中和抗体的RBD逃逸突变谱，并表明这些中和抗体可以通过无监督聚类分为六个表位组(A-F)，这一分组与基于知识的结构分类高度一致。Omicron的各种单突变可以损害不同表位组的中和抗体。具体来说，A-D组的中和抗体，其表位与ACE2结合基序重叠，主要被K417N, G446S, E484A和Q493R逃逸。E组(例如S309)和F组(例如CR3022)的抗体通常表现出广泛的沙贝病毒中和活性，受Omicron影响较小，但一部分中和抗体仍被G339D、N440K和S371L逃逸。此外，Omicron假病毒中和表明，由于表位上的多个协同突变，能够耐受单突变的中和抗体也可能被逃逸。总的来说，超过85%的测试中和抗体被Omicron逃逸。对于基于中和抗体的药物，LY-CoV016、LY-CoV555、REGN10933、REGN10987、AZD1061、AZD8895和BRII-196的中和能力被Omicron大大削弱，而VIR-7831和DXP-604仍能发挥降低的功效。总之，我们的数据表明，感染Omicron会导致相当大的体液免疫逃逸，而靶向沙贝病毒保守区的中和抗体将保持最有效。我们的研究结果为针对Omicron和未来变异株的抗体药物和疫苗的开发提供了信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Omicron变异株如何逃逸RBD靶向的中和抗体，以及哪些抗体仍有效？
- 核心机制
- Omicron的RBD突变（如K417N、G446S、E484A、Q493R）破坏A-D组抗体的表位，而E、F组抗体由于靶向沙贝病毒保守区域而相对耐受，但部分仍被G339D、N440K、S371L等突变逃逸。
- 主要证据
- 通过酵母展示突变筛选绘制247种抗体的逃逸图谱，结合假病毒中和实验，显示超过85%的抗体被Omicron逃逸，且多突变协同效应增强逃逸。
- 研究意义
- 表明Omicron感染导致显著的体液免疫逃逸，靶向沙贝病毒保守区的抗体（如VIR-7831）可能对疫苗和抗体药物开发有重要价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组抗体生产和验证
表达抗体用于后续功能实验
将重链和轻链基因克隆到表达载体，共转染HEK293F细胞，纯化抗体，通过ELISA验证结合特异性。
高通量酵母展示突变筛选
绘制每个抗体对RBD单突变逃逸的图谱
构建RBD突变文库，利用MACS方法筛选逃逸抗体结合的酵母，通过PacBio和Illumina测序确定突变与条形码对应，计算逃逸分数。
抗体分组和表位分类
根据逃逸谱将247种抗体划分为六个表位组
基于逃逸分数矩阵，计算抗体间Pearson相关距离，使用MDS和k-medoids聚类，并用t-SNE可视化。
假病毒中和实验
评估抗体对Omicron等变异株的中和能力
使用VSV假病毒（携带Omicron spike突变）感染Huh-7细胞，测定IC50。
ELISA和BLI结合实验
验证抗体对Omicron RBD的结合能力
ELISA测定抗体与野生型、Omicron RBD的结合；BLI测定亲和力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
抗体发现和测序
逃逸突变图谱分析
数据分析与聚类
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PBMC分离 | Ficoll | Cytiva | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| 细胞保存 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- |
| B细胞富集 | CD19+ B细胞分离试剂盒 | STEMCELL | -- |
| 流式染色 | FITC抗CD19抗体 | Biolegend | 392508 |
| FITC抗CD20抗体 | Biolegend | 302304 | |
| Brilliant Violet 421抗CD27抗体 | Biolegend | 302824 | |
| PE/Cyanine7抗IgM | Biolegend | 314532 | |
| 7-AAD | eBioscience | 00-6993-50 | |
| 链霉亲和素-PE | Biolegend | 405204 | |
| 链霉亲和素-APC | Biolegend | 405207 | |
| 流式分选 | Astrios EQ | Beckman Coulter | -- |
| 测序 | Novaseq 6000 | Illumina | -- |
| 抗体表达 | HEK293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | R79007 |
| ELISA | SARS-CoV-2 RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V27H-B |
| SARS-CoV-1 RBD蛋白 | Sino Biological | 40634-V27H-B | |
| 山羊抗人IgG（H+L）/HRP | Jackson | 109-035-003 | |
| 假病毒中和实验 | Huh-7细胞 | -- | -- |
| 荧光素酶底物 | PerkinElmer | -- | |
| BLI | Octet R8蛋白分析系统 | ForteBio | -- |
| 蛋白A生物传感器 | ForteBio | -- | |
| Omicron RBD蛋白 | Sino Biological | 40592-V08H85 | |
| 酵母展示筛选 | pETcon 2 质粒 | -- | -- |
| 酵母转化 | LiAc/SS载体DNA/PEG法 | -- | -- |
| MACS筛选 | 生物素结合磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 生物素化ACE2蛋白 | Sino Biological | -- | |
| 蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗c-Myc磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 酵母质粒提取试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| Ampure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 测序 | PacBio Sequel ll平台 | PacBio | -- |
| Illumina Nextseq 500 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | R包cluster | -- | -- |
| R包ggplot2 | -- | -- | |
| R包ComplexHeatmap | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PBMC分离 | 血液样本稀释比例、Ficoll离心条件、红细胞裂解步骤 阅读提示：Methods: Isolation of human peripheral blood mononuclear cells |
| B细胞分选 | 抗体用量、染色温度和时间、FACS分选门控策略 阅读提示：Methods: Antigen-specific B cell sorting and sequencing; Extended Data Fig. S2 |
| 重组抗体表达 | 转染细胞系、培养条件、纯化方法 阅读提示：Methods: Recombinant antibody production |
| 酵母展示筛选 | 突变库构建方法、ACE2阳性选择、MACS阴性选择轮次和磁珠类型 阅读提示：Methods: Construction of RBD deep mutational scanning library; MACS-based profiling of escape mutations |
| 假病毒中和实验 | 假病毒构建、细胞系、病毒和抗体孵育时间、IC50计算模型 阅读提示：Methods: Pseudovirus neutralization assay |
| ELISA | RBD包被浓度、抗体浓度、孵育时间和温度、阳性判定标准 阅读提示：Methods: ELISA |