纵向队列建立与样本采集
评估疫苗接种后的免疫反应动态。
42名无感染史的志愿者接受两剂mRNA疫苗(Moderna或Pfizer-BioNTech),并在多个时间点采集血液样本。
Increased memory B cell potency and breadth after a SARS-CoV-2 mRNA boost
研究包含纵向人群队列、体外细胞模型、假病毒中和实验、流式细胞术、单细胞抗体测序、BLI表位作图等多项独立实验层级,并进行功能验证和机制探究。
纵向队列的人类外周血B细胞 293TAce2细胞系 HT1080Ace2cl.14细胞系 SARS-CoV-2假病毒
三剂mRNA疫苗(Moderna或Pfizer-BioNTech) 纵向时间点(首次接种后2.5周、第二剂后1.3和5个月、第三剂后1个月) RBD特异性记忆B细胞分离与单细胞测序 假病毒中和实验(包含Wuhan-Hu-1、Beta、Delta、Omicron BA.1) BLI表位分类
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估疫苗接种后的免疫反应动态。
42名无感染史的志愿者接受两剂mRNA疫苗(Moderna或Pfizer-BioNTech),并在多个时间点采集血液样本。
检测血浆中抗RBD抗体水平和中和能力随时间的变化。
通过ELISA测量血浆IgM、IgG、IgA结合水平;使用SARS-CoV-2假病毒中和实验测定NT50。
确定第三剂对记忆B细胞数量和克隆组成的影响。
通过流式细胞术分选RBD特异性记忆B细胞,并进行单细胞测序以分析克隆性和体细胞高频突变。
评估记忆B细胞克隆编码的中和抗体效力和广谱性。
克隆表达472个单克隆抗体,通过ELISA测试结合,通过假病毒中和实验测定IC50,并进行表位竞争实验。
探究抗体表位分布如何变化以及对变异株的中和广度。
通过BLI竞争实验确定抗体类别,并比较持久克隆和新出现克隆的抗体对变异株的中和活性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA | 康宁96孔半面积板(3690) | Corning | -- |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | -- | |
| TMB底物 | ThermoFisher | -- | |
| HRP标记的抗人IgG二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| HRP标记的抗人IgM二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| HRP标记的抗人IgA二抗 | Sigma | -- | |
| 酶标仪(FluoStar Omega) | BMG Labtech | -- | |
| 假病毒中和实验 | Nano-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 荧光素酶细胞裂解液5x | Promega | -- | |
| Glomax Navigator(发光检测仪) | Promega | -- | |
| 293TAce2细胞 | -- | -- | |
| HT1080Ace2cl.14细胞 | -- | -- | |
| 293T细胞 | ATCC | -- | |
| 生物素化 | BirA生物素蛋白连接酶试剂盒 | Avidity | -- |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | 泛B细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-101-638 |
| 链霉亲和素-藻红蛋白 | BD Biosciences | 554061 | |
| 链霉亲和素-AF647 | BioLegend | 405237 | |
| 链霉亲和素-BV711 | BD Biosciences | 563262 | |
| 链霉亲和素-BB515 | BD Biosciences | 564453 | |
| 抗CD20-PECy7抗体 | BD Biosciences | 335793 | |
| 抗CD3-APC-eFluro 780抗体 | Invitrogen | 47-0037-41 | |
| 抗CD8-APC-eFluor 780抗体 | Invitrogen | 47-0086-42 | |
| 抗CD16-APC-eFluor 780抗体 | Invitrogen | 47-0168-41 | |
| Zombie NIR(活/死染料) | BioLegend | 423105 | |
| AccuCheck计数微球 | Life Technologies | PCB100 | |
| RNasin核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2615 | |
| FACSAria III(流式细胞仪) | Becton Dickinson | -- | |
| FACSDiva软件 | Becton Dickinson | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 抗IgD-BV650抗体 | BD | 740594 | |
| 抗CD27-BV786抗体 | BD Biosciences | 563327 | |
| 抗CD19-BV605抗体 | BioLegend | 302244 | |
| 抗CD71-PerCP-Cy5.5抗体 | BioLegend | 334114 | |
| 抗IgG-PECF594抗体 | BD | 562538 | |
| 抗IgM-AF700抗体 | BioLegend | 314538 | |
| 抗IgA-Viogreen抗体 | Miltenyi Biotec | 130-113-481 | |
| 抗体测序 | SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | 18080-044 |
| BLI | Octet Red仪器(生物层干涉仪) | ForteBio | -- |
| 蛋白A生物传感器 | ForteBio | 18-5010 | |
| ForteBio缓冲液 18-1105 | ForteBio | -- | |
| 动物实验 | 卵清蛋白 | Sigma | A5503-1G |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 参与者队列 | 参与者为无感染史的42名健康志愿者,接受Moderna或Pfizer-BioNTech疫苗,年龄23-78岁,48%男性,52%女性。 阅读提示:Methods: Study participants |
| 样本采集 | 时间点:首剂后2.5周、第二剂后1.3和5个月、第三剂后1个月。 阅读提示:Methods: 时间点描述 |
| 血浆抗体检测 | ELISA检测抗RBD IgG、IgM、IgA;假病毒中和实验测定NT50。 阅读提示:Methods: ELISAs, Pseudotyped virus neutralization assay |
| 记忆B细胞分析 | 流式细胞术分选RBD特异性B细胞,单细胞测序分析抗体序列。 阅读提示:Methods: Flow cytometry and single-cell sorting, Antibody sequencing |
| 单克隆抗体功能 | 表达472个单抗,ELISA测结合,假病毒中和实验测IC50,BLI进行表位分类。 阅读提示:Methods: Antibody sequencing, cloning and expression, Biolayer interferometry |