遗传工程小鼠模型构建
构建携带人类 HCC 常见驱动基因组合的、具有免疫活性的原位小鼠模型，模拟人类 HCC 的克隆起源、组织病理学和转移特征。
通过尾静脉注射 AAV8.TBG.cre 病毒，在成年小鼠肝细胞中诱导条件性等位基因重组，产生自发性肿瘤。共构建了 35 个遗传背景不同的小鼠模型，监测至少 230 天。
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人类相关遗传模型识别肝癌精准治疗
Human-correlated genetic models identify precision therapy for liver cancer
实验完整度
高包含多层级证据：体外类器官药物筛选、体内遗传工程小鼠模型药效验证、患者样本转录组验证、组织病理学与免疫组化分析，且包含机制验证。
主要模型
Ctnnb1ex3/WT R26LSL-MYC/LSL-MYC 小鼠（BM 模型，Cohort 5） Ctnnb1ex3/WT R26LSL-MYC/LSL-MYC Ptenfl/fl Trp53R172H/WT Cdkn2aKO/KO 小鼠（Cohort 23） R26LSL-MYC/LSL-MYC KrasG12D/WT 小鼠（Cohort 45） 小鼠及人源 HCC 类器官（HCCO）
重点核对
AAV8.TBG.cre 诱导剂量（6.4×10^8 GC/小鼠）及性别差异 治疗起始时间（BM 模型为诱导后第 90 天） 克拉屈滨给药方案（20 mg/kg，腹腔注射，每日一次） 索拉非尼给药方案（45 mg/kg，口服灌胃，每日一次） 仑伐替尼给药方案（10 mg/kg，口服灌胃，每日一次）
摘要
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，是全球癌症相关死亡的主要原因之一。HCC通常发生在慢性肝病背景下，由一系列易感因素引起。肿瘤的发展是由积累进行性驱动突变的克隆扩增驱动的，肝细胞是最可能的起源细胞。然而，HCC中驱动突变的景观大致独立于潜在的病因。尽管晚期HCC的全身治疗选择越来越多，但预后仍然异质且通常较差。新兴数据表明，药物疗效取决于疾病病因和遗传改变。在具有人类相关性的临床前模型中探索亚型对于推进HCC的精准医学至关重要。在这里，我们生成了一套遗传驱动的免疫活性体内和匹配的体外HCC模型。我们的模型代表了人类HCC的多个特征，包括克隆起源、组织病理学外观和转移。我们将小鼠模型的转录组数据与人类HCC数据整合，确定了四个共同的人类-小鼠亚型簇。这些亚型簇具有独特的转录组特征，与人类组织病理学一致。在概念验证分析中，我们验证了对标准治疗的反应，并使用链接的体外-体内管道确定了一个有前景的治疗候选药物克拉屈滨，该药物以前未与HCC治疗相关联。克拉屈滨以高度有效的亚型特异性方式与标准治疗联合发挥作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何构建具有人类相关性的 HCC 临床前模型，以识别亚型特异性治疗策略？
- 核心机制
- 克拉屈滨作为核苷类似物，通过干扰 DNA 合成抑制肿瘤细胞增殖，并在体内诱导肿瘤微环境中 CD3+ T 细胞浸润，从而与仑伐替尼协同发挥抗肿瘤作用（文中未明确验证具体信号通路）。
- 主要证据
- 在 BM 小鼠模型中，克拉屈滨单药或联合仑伐替尼显著延长生存期，联合治疗几乎完全根除肿瘤；免疫组化显示联合治疗减少 Ki-67+ 增殖细胞并增加 CD3+ T 细胞浸润；免疫检查点抑制剂预治疗进一步增强抗肿瘤效果。
- 研究意义
- 该研究提供了一个可扩展的临床前平台，用于快速药物重定位和亚型特异性治疗策略的验证，为 HCC 精准医学提供资源，并可能适用于其他实体瘤的转化研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
跨物种转录组比对与亚型鉴定
确定小鼠模型与人类 HCC 在转录组水平上的相似性，并识别共同亚型。
对小鼠模型（GEMM、TOX、OT）和人类 TCGA HCC 样本进行转录组分析，使用 UMAP 降维和 Louvain 聚类，鉴定出四个 HuMo 簇，并验证了其与组织病理学和预后的关联。
标准治疗反应评估
评估代表性的 HuMo 簇1 模型（BM 小鼠）对当前标准治疗（TKI、ICI）的反应。
对 BM 小鼠进行索拉非尼、仑伐替尼、抗 PD-1 及 VEGFRi 联合治疗，监测生存期和肿瘤负担。结果显示 TKI 显著延长生存期，而 ICI 或联合治疗未改善生存期。
体外药物筛选与验证
在类器官模型中筛选并验证针对 HuMo 簇1 的潜在治疗药物。
利用 BM 小鼠来源的 HCC 类器官（HCCOs）进行 147 种 FDA 批准的抗癌药物高内涵筛选，发现抗代谢物（特别是克拉屈滨）最有效。随后在多个小鼠和人源 HCCOs 中验证了克拉屈滨的剂量依赖性疗效，并测试了其他抗代谢物。
体内疗效验证
验证克拉屈滨单药或联合仑伐替尼在不同 HuMo 簇模型中的疗效。
在 BM（HuMo 1）、Cohort 23（HuMo 4）和 Cohort 45（HuMo 2）小鼠中给予克拉屈滨单药或联合仑伐替尼，监测生存期、肿瘤负担和免疫浸润。结果显示克拉屈滨联合治疗在 HuMo 1 和 4 模型中有效，但在 HuMo 2 模型中无效。
免疫微环境分析
评估克拉屈滨联合治疗对肿瘤免疫微环境的影响。
通过免疫组化和多重免疫荧光分析，检测肿瘤中 Ki-67、CD3、CD8、CD4 等标记物，发现联合治疗增加肿瘤内 CD3+ T 细胞浸润，并可增强抗 PD-1 疗效。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | AAV8.TBG.PI.cre.rBG | Addgene | 107787-AAV8 |
| AAV8.TBG.PI.eGFP.WPRE.bGH | Addgene | 105535-AAV8 | |
| 药物处理 | 索拉非尼 | LC Laboratories | S8502 |
| 仑伐替尼 | SelleckChem | S1164 | |
| 克拉屈滨 | SelleckChem | S1199 | |
| 抗 PD1 抗体 (RMP1-14) | BioLegend | -- | |
| VEGFR 抑制剂 (AZD2171) | AstraZeneca | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| BME2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| TrypLE | -- | -- | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | |
| B-27 补充剂 | Gibco | 17504001 | |
| N-2 补充剂 | Gibco | 17502001 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| [Leu15]-胃泌素 | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| 毛喉素 | Tocris | 1099 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | AF-100-15 | |
| 成纤维细胞生长因子 10 | Peprotech | 100-26 | |
| 肝细胞生长因子 | Peprotech | 100-39 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTitre-Glo 3D 试剂 | Promega | G9682 |
| 高通量筛选 | Incucyte NucLight Rapid Red | Sartorius | 4717 |
| 组织化学 | DAB 显色试剂盒 | Agilent | K3468 |
| DAB 显色试剂盒 | Leica | DS92563 | |
| DAB 显色试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| 免疫荧光 | DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 |
| Opal 荧光团酪酰胺信号放大系统 | Akoya Biosciences | -- | |
| ImmPRESS 大鼠抗体检测试剂 | -- | -- | |
| Opal 780 | Akoya Biosciences | -- | |
| TOMO 亲水粘附显微镜载玻片 | Matsunami | 0808228600 | |
| 红细胞裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | |
| 流式细胞术 | 含布雷菲德菌素 A 的细胞激活混合物 | BioLegend | 423304 |
| Brilliant 染色缓冲液 | BD Biosciences | 566349 | |
| Zombie NIR 可固定活力染料 | BioLegend | 423106 | |
| FOXP3 转录因子固定/破膜液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ultracomp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| 组织解离 | gentleMACS Octo 解离器（带加热器） | Miltenyi Biotec | -- |
| 小鼠肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | |
| DNA 提取 | Monarch 基因组 DNA 纯化试剂盒 | New England Biolabs | T3010L |
| PCR | OneTaq Quick-Load 2× 预混液（含标准缓冲液） | New England Biolabs | M0486S |
| 凝胶电泳 | 琼脂糖 | Melford | A20090-500 |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA 分子量标准 | New England Biolabs | N0550S | |
| SYBR Safe DNA 凝胶染料 | Invitrogen | S33102 | |
| 转录组测序 | Trizol 试剂 | Invitrogen | -- |
| Lexogen QuantSeq FWD 试剂盒 | Lexogen | -- | |
| Illumina TruSeq 链特异性 mRNA 试剂盒 | Illumina | -- | |
| NextSeq 500 测序系统 | Illumina | -- | |
| RNA 质量分析 | Nanodrop 2000 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Agilent 2200 TapeStation | Agilent | -- | |
| 显微镜成像 | Zeiss Axiovert 200 显微镜 | Zeiss | -- |
| Zeiss Axiocam MRc 相机 | Zeiss | -- | |
| Leica Aperio AT2 玻片扫描仪 | Leica Microsystems | -- | |
| Zeiss 710 共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 图像分析 | HALO 图像分析软件 | Indica Labs | -- |
| Columbus 图像分析软件 | Perkin Elmer | -- | |
| InForm 软件 | Akoya Biosciences | -- | |
| Visiopharm 软件 | -- | -- | |
| Icy BioImage 软件 | -- | -- | |
| 高内涵成像 | Opera Phenix 高内涵筛选系统 | Perkin Elmer | -- |
| 免疫荧光染色平台 | Ventana Discovery Ultra 平台 | Roche Tissue Diagnostics | -- |
| 免疫荧光染色 | Opal 480 | Akoya Biosciences | -- |
| Opal 520 | Akoya Biosciences | -- | |
| Opal 570 | Akoya Biosciences | -- | |
| Opal 620 | Akoya Biosciences | -- | |
| Opal 650 | Akoya Biosciences | -- | |
| Opal 690 | Akoya Biosciences | -- | |
| Opal 780 | Akoya Biosciences | -- | |
| DAPI 复染液 | Roche Tissue Diagnostics | 05268826001 | |
| DAPI 复染液 | Akoya | 232121 | |
| 抗原修复液 (CC1) | Roche Tissue Diagnostics | 06414575001 | |
| 抗原修复液 (CC2) | Roche Tissue Diagnostics | 05279798001 | |
| 光谱扫描 | PhenoImager HT 多光谱玻片扫描仪 | Akoya Biosciences | -- |
| MRI 成像 | nanoScan 成像系统 | Mediso Medical Imaging Systems | -- |
| VivoQuant 软件 | InviCRO | -- | |
| 化学诱导模型 | 二乙基亚硝胺 (DEN) | -- | -- |
| 链脲佐菌素 (STZ) | -- | -- | |
| 饮食诱导模型 | 改良西方饮食 (MWD) | Envigo | TD.120528 |
| ALIOS 饮食 | Envigo | TD.110201 | |
| 高脂饮食 | TestDiet | 58R3, | |
| 细胞系 | Hep-53.4 细胞 | Cytion | LOT-L230232R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 模型构建 | AAV8.TBG.cre 病毒剂量（6.4×10^8 GC/只）、注射途径（尾静脉）、小鼠性别、年龄、遗传背景 阅读提示：Methods: Mice, diets and treatments |
| 药物治疗 | 索拉非尼剂量 45 mg/kg 口服；仑伐替尼剂量 10 mg/kg 口服；克拉屈滨剂量 20 mg/kg 腹腔注射；抗 PD1 剂量 200 μg/只腹腔注射；VEGFRi 剂量 3 mg/kg 口服；治疗起始时间 阅读提示：Methods: Mice, diets and treatments |
| 肿瘤评估 | 终点定义（肝重/体重比 >20% 或出现不利副作用）、肿瘤计数、肿瘤大小测量、组织学评估标准 阅读提示：Methods: Animal tissue collection, Histology and immunohistochemistry |
| 体外药物筛选 | HCCO 培养条件、种植密度、药物浓度、处理时间、细胞活力检测方法 阅读提示：Methods: Mouse HCCO culture, drug screening and imaging |
| 转录组分析 | RNA 提取方法、测序平台、比对软件、聚类参数 阅读提示：Methods: Whole-tumour RNA-seq, Computational disease positioning based on human TCGA data |