计算设计
设计靶向蛋白质-配体复合物新表面的蛋白质结合物
使用MaSIF-neosurf识别新表面的结合位点，从约640,000个结构片段数据库中搜索互补指纹（种子），优化序列并嫁接到支架蛋白上，生成约2,000个最终设计。
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用可泛化的深度学习工具靶向蛋白质-配体新表面
Targeting protein-ligand neosurfaces with a generalizable deep learning tool
实验完整度
高包含计算设计、酵母展示筛选、体外亲和力测定、结构解析（晶体和冷冻电镜）以及细胞功能验证（细胞外、细胞内和CAR-T）等多个独立证据层级，并进行机制验证。
主要模型
Bcl2–venetoclax复合物 DB3–progesterone复合物 PDF1–actinonin复合物 HEK293T细胞 原代小鼠T细胞
重点核对
靶蛋白和小分子的浓度（如500 nM用于酵母展示） 小分子类似物（S55746、OBz-Pro、TBDMS-Act）用于特异性验证 关键残基点突变（如M3L、I13K等）用于亲和力优化 酵母展示筛选的条件（如SDCAA、SGCAA培养基，FACS分选） CAR-T细胞杀伤试验中效应细胞与靶细胞的比例为1:1
摘要
蛋白质之间的分子识别事件驱动着生命系统中的生物过程1。然而，出现了更高层次的机制调控，其中蛋白质-蛋白质相互作用受到小分子的调节2-5。尽管最近取得了进展，但用于设计新的化学诱导蛋白质相互作用的计算工具仍然是该领域的一项艰巨任务6,7。这里我们提出了一种计算策略，用于设计靶向新表面（即蛋白质-配体复合物产生的表面）的蛋白质。为了开发这一策略，我们利用了一种基于学习到的分子表面表征8,9的几何深度学习方法，并针对三个药物结合的蛋白质复合物：Bcl2–venetoclax、DB3–progesterone和PDF1–actinonin，实验验证了结合物。所有结合物都表现出高亲和力和准确的特异性，如通过突变和结构表征所评估的。值得注意的是，先前仅在蛋白质上训练的表面指纹可应用于由小分子相互作用诱导的新表面，这提供了在其他深度学习方法中不常见的泛化性的有力证明。我们预计，这种设计的化学诱导蛋白质相互作用将有可能扩展传感库和新合成途径的组装，用于工程细胞中创新的药物控制的细胞疗法10。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用基于分子表面特征的几何深度学习方法，泛化设计靶向蛋白质-配体复合物（新表面）的蛋白质结合物，从而实现化学诱导的蛋白质相互作用？
- 核心机制
- 通过将小分子纳入蛋白质分子表面表征，学习新表面的几何和化学特征，设计出仅在存在特定小分子时才结合的蛋白质，从而实现药物诱导的蛋白质二聚化。
- 主要证据
- 针对三个靶标（Bcl2-venetoclax、DB3-progesterone、PDF1-actinonin）设计的结合物在酵母展示中表现出小分子依赖性结合，表面等离子体共振或生物层干涉测量显示亲和力达到纳摩尔至微摩尔范围，晶体和冷冻电镜结构验证了设计结合模式。
- 研究意义
- 为设计化学诱导的蛋白质相互作用提供了可泛化的方法，有望用于开发药物控制的细胞疗法、生物传感器和合成生物学模块。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
酵母展示筛选
从计算设计的库中筛选能结合靶蛋白-配体复合物的结合物
将编码设计的基因文库展示在酵母表面，通过流式细胞术分选并结合深度测序，以富集结合物。
体外验证
验证设计的结合物是否以高亲和力和特异性结合靶蛋白-配体复合物
表达并纯化候选结合物，通过表面等离子体共振或生物层干涉测量测定亲和力，并用小分子类似物对照验证特异性。
结构验证
确认设计的结合模式
对DBAct553_1与actinonin结合的PDF1的复合物进行共结晶并解析晶体结构，对DBPro1156_2与孕酮结合的DB3的复合物进行冷冻电镜结构解析。
细胞功能验证
证明设计的化学诱导二聚化系统在细胞环境中可作为功能开关
在无细胞系统、哺乳动物细胞（HEK293T）和原代小鼠T细胞中测试基于设计的CID的ON开关系统，包括荧光报告系统、分裂NanoLuc系统和CAR-T细胞杀伤试验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达与纯化 | pET11载体 | -- | -- |
| pHLSec载体 | -- | -- | |
| Expi293表达系统 | Thermo Fisher | A14635 | |
| Ni-NTA HisTrap亲和柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex HiLoad 16/600 75 pg | GE Healthcare | -- | |
| ÄKTA Pure系统 | GE Healthcare | -- | |
| 酵母表面展示 | pCTcon2载体 | -- | -- |
| Frozen-EZ酵母转化II试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| 流式细胞术 | FITC偶联山羊抗HA标签抗体 | Bethyl | A190-138F |
| PE偶联山羊抗人Fc抗体 | Invitrogen | 12-4317-87 | |
| Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Sony SH800细胞分选仪 | Sony | -- | |
| Kaluza软件 | Beckman Coulter | v.1.1.20388.18228 | |
| FlowJo | BD Biosciences | v.10.8.1 | |
| 文库测序 | Zymoprep酵母质粒小提试剂盒II | Zymo Research | -- |
| Qiaquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Illumina MiSeq系统 | Illumina | -- | |
| 亲和力测定 | Biacore 8K | GE Healthcare | v.4.0.8.19879 |
| CM5芯片 | GE Healthcare | 29104988 | |
| Gator系统 | Gator Bio | v.2.7.3.0728 | |
| Creoptix WAVE系统 | Malvern Panalytical | -- | |
| 4PCH芯片 | Malvern Panalytical | -- | |
| 生化表征 | SEC-MALS | Wyatt | -- |
| Superdex 75 10/300 GL色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| Chirascan光谱仪 | AppliedPhotophysics | -- | |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | Invitrogen | R70007 |
| DMEM培养基 | Gibco | 41966-029 | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765-1 |
| 细胞功能测定 | Nano-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | N1120 |
| Nano-Glo活细胞检测试剂盒 | Promega | N2012 | |
| Tecan Spark酶标仪 | Tecan | -- | |
| 细胞无细胞表达 | PURExpress试剂盒 | NEB | E6800S |
| 二硫键增强剂 | NEB | E6820S | |
| NEBExpress Iq感受态大肠杆菌 | NEB | C3037I | |
| Ni-NTA IMAC Sepharose重力柱 | -- | -- | |
| CAR-T细胞制备 | Phoenix-ECO细胞 | ATCC | CRL-3214 |
| Miltenyi Biotec分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-130 | |
| αCD3/CD28激活磁珠 | Gibco | 11452D | |
| 人IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 人IL-7/IL-15 | PeproTech | 200-7/200-15 | |
| 生物素化HER2蛋白 | AcroBiosystems | HE2-H822R | |
| PE偶联链霉亲和素 | Invitrogen | 12-4317-87 | |
| A647偶联抗FLAG抗体 | Thermo Fisher | MA1-142-A647 | |
| FITC偶联抗V5抗体 | GeneTex | GTX21209 | |
| 细胞毒性试验 | Incucyte Nuclight Red | Sartorius | -- |
| 蛋白纯化（结晶） | Tris缓冲液 | -- | -- |
| 结晶 | 甲酸钠 | -- | -- |
| 聚乙二醇 | -- | -- | |
| 甘油 | -- | -- | |
| X射线衍射 | XDS | -- | -- |
| autoPROC | GlobalPhasing | v.20230222 | |
| 结构解析 | Phenix | -- | v.1.20.1-4487 |
| Coot | -- | v.0.9.5 | |
| MolProbity | -- | v.4.5.1 | |
| 冷冻电镜样品制备 | ExpiCHO-S细胞 | Thermo Fisher Scientific | A29127 |
| ProCHO-5培养基 | Lonza | -- | |
| 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | -- | -- | |
| 冷冻电镜 | FEI Titan Krios G4显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cryoSPARC | -- | v.4.4.1 | |
| 结构分析 | ChimeraX | UCSF | v.1.3 |
| PyMOL | Schrödinger | v.2.4 | |
| 化学合成 | 19-羟基孕酮 | -- | -- |
| 苯甲酰氯 | -- | -- | |
| 肌动蛋白素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 计算设计 | MaSIF-neosurf的参数、种子数据库、支架数据库、序列设计参数 阅读提示：Methods部分'Computational design'及补充表1 |
| 酵母展示筛选 | 标签浓度（500 nM）、靶蛋白与小分子预孵育比例（1:5-10）、抗体稀释倍数、细胞密度、诱导时间 阅读提示：Methods部分'Library screening'和'Flow cytometry analysis and sorting' |
| 亲和力测定 | 固定化水平、分析物浓度范围、接触时间、解离时间、缓冲液组成 阅读提示：Methods部分'Surface plasmon resonance'、'Biolayer interferometry'和'Grating-coupled interferometry' |
| 结构解析 | 蛋白浓度、结晶条件、衍射数据收集参数、冷冻电镜数据收集参数 阅读提示：Methods部分'Protein purification for crystallography'、'Crystallographic data collection and structure determination'和'Cryo-EM preparation and data acquisition' |
| 细胞功能验证 | 细胞系、转染DNA量、诱导剂浓度、检测时间点 阅读提示：Methods部分'Cell transfection and induction'、'Cellular detection assay'和'Cytotoxicity assay of murine CAR-T cells' |