验证iPSC-CFs对基质硬度的敏感性
评估人iPSC来源心脏成纤维细胞是否对微环境力学敏感，并自发转分化为MyoFb。
将iPSC-CFs培养在不同硬度（0.1-64 kPa）的水凝胶上、刚性塑料加或不加机械抑制药物，以及不同细胞密度下，通过免疫荧光检测αSMA和YAP1，并统计αSMA阳性细胞比例和YAP1核/质比。
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选择性抑制基质机械感觉抑制心脏纤维化
Selective inhibition of stromal mechanosensing suppresses cardiac fibrosis
实验完整度
高包含体外iPSC-CF模型、水凝胶软化系统、scRNA-seq、CoIP-MS、EHT、TAC小鼠模型等多层级实验，并进行了功能与机制验证。
主要模型
人iPSC来源心脏成纤维细胞（iPSC-CFs） 光响应水凝胶上的TAGLN-CFP报告MyoFb 工程心脏组织（EHT） 小鼠TAC心力衰竭模型
重点核对
iPSC-CFs在刚性基底上自发活化，YAP核定位与αSMA表达相关 动态软化基质与TGFβ抑制剂联合处理诱导MyoFb向静息表型转变 SRC在心脏基质细胞中富集，其磷酸化在TAC模型中随纤维化进展而增加 双药联合（SAR+PFD）在TAC模型中抑制纤维化并改善心功能 MRTF-A与SORBS2的相互作用在软基质+TGFβi处理下被破坏
摘要
已知基质来源的生物物理线索调节成纤维细胞的活化及其随后向肌成纤维细胞的转分化，但调节这些信号是否能在完整组织中抑制纤维化仍不清楚，尤其是在心血管系统中。在这里，我们跨多个尺度证明，在持续活化的心脏成纤维细胞中抑制基质机械感觉，与TGFβ通路的可溶性调节因子协同，促进向静息状态的强健的转录组、形态和代谢转变。通过对公共人类和小鼠单细胞测序数据集进行荟萃分析，我们确定了黏着斑相关酪氨酸激酶SRC是一种成纤维细胞富集的机械传感器，可以选择性地靶向基质细胞以模拟体内基质软化的效果。saracatinib对SRC的药理学抑制，结合TGFβ抑制，协同抑制成纤维细胞中关键的促纤维化基因程序，其特征是对MRTF-SRF通路的显著抑制，而单独使用任一药物均未见此效果。重要的是，双重治疗减轻了纤维化工程心脏组织和心力衰竭小鼠模型中的收缩功能障碍。我们的研究结果表明，联合抑制SRC介导的基质机械感觉和TGFβ信号传导可能作为治疗心血管纤维化的机械治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抑制基质机械感觉是否能在完整组织中抑制纤维化，特别是心血管系统，以及如何实现？
- 核心机制
- 联合抑制SRC介导的基质机械感觉和TGFβ信号通路，通过协同抑制MRTF-SRF通路，促使活化心脏成纤维细胞向静息状态转变，减轻纤维化并改善心脏功能。
- 主要证据
- 体外iPSC-CF模型、动态软化水凝胶、scRNA-seq、CoIP-MS、EHT和TAC小鼠模型表明，双重治疗抑制促纤维化基因程序，减少αSMA、胶原I、POSTN等蛋白表达，并恢复收缩功能。
- 研究意义
- 该研究首次证明了双重'机械疗法'对心肌纤维化的概念验证，为治疗心血管纤维化提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
scRNA-seq分析验证iPSC-CFs细胞身份
确认iPSC-CFs与体内心脏成纤维细胞的转录组相似性，并识别活化MyoFb亚群。
对TGFβ刺激4天的iPSC-CFs进行scRNA-seq，并映射到人胎儿组织成纤维细胞和成人心脏（健康与DCM）参考数据集，进行聚类、轨迹推断和基因本体分析。
动态软化基质联合TGFβ抑制诱导MyoFb逆转
测试动态基质软化结合TGFβ抑制是否能逆转已活化的MyoFb状态。
将TAGLN-CFP报告MyoFb接种在光响应水凝胶上，软化基质（从~28 kPa至~8 kPa）联合5 μM SB431542处理，通过延时成像、免疫荧光和scRNA-seq分析细胞形态、αSMA表达和转录组变化。
鉴定软基质+TGFβi诱导的转录因子变化
分析软基质+TGFβi处理下转录因子活性的变化，寻找关键调控因子。
使用DoRothEA对scRNA-seq数据进行转录因子活性分析，比较不同处理组间的TF活性，并通过免疫印迹验证蛋白水平变化。
CoIP-MS鉴定MRTF-A相互作用蛋白
研究软基质+TGFβi如何协同抑制MRTF-SRF通路，鉴定关键相互作用蛋白。
对MyoFb和不同处理组的细胞进行MRTF-A免疫沉淀和质谱分析，比较差异相互作用蛋白，并通过免疫荧光和FRAP验证SORBS2与MRTF-A的相互作用及对MRTF-A核质转运的影响。
单细胞数据集荟萃分析鉴定SRC为基质富集机械传感器
在多个心脏单细胞数据集中寻找基质细胞富集的机械传感器，以模拟基质软化效果。
对6个公开的scRNA-seq数据集（包括健康、DCM、胎儿、小鼠心脏）进行SRC表达分析，并通过Western blot验证TAC模型中SRC的磷酸化水平。
虚拟筛选和分子动力学模拟鉴定saracatinib为SRC抑制剂
通过虚拟筛选和分子动力学模拟，从超过10,000个化合物中鉴定SRC的小分子抑制剂。
使用AutoDock Vina进行虚拟筛选，并对前5个候选化合物进行100 ns的MD模拟，评估与SRC结合口袋的稳定性和相互作用能量，最终确定saracatinib为最佳候选。
体外验证saracatinib模拟基质软化效果
验证saracatinib是否能模拟基质软化的效果，与TGFβ抑制剂联合使用是否能协同抑制MyoFb。
对MyoFb进行saracatinib（SAR）单独或与SB431542（SB）或pirfenidone（PFD）联合处理，通过免疫荧光和免疫印迹检测αSMA、YAP1亚细胞定位、MRTF-A定位等，并检测代谢变化。
EHT模型评估双重治疗对收缩功能的影响
在工程心脏组织中测试药物组合对纤维化收缩功能障碍的治疗效果。
制备含有iPSC-CMs和iPSC-CFs的EHTs，并用TGFβ刺激诱导纤维化，然后给予SAR+PFD或单药处理，测量EHT的收缩分数、舒张长度和刚度。
体内TAC和MI模型评估双重治疗的抗纤维化效果
在两种不同的心力衰竭模型中评估SAR+PFD组合疗法的抗纤维化效果和功能改善。
对小鼠进行TAC或MI手术，术后给予SAR+PFD或单药治疗，通过组织学、超声心动图和snRNA-seq评估纤维化面积、心功能和转录组变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | BD | CB-40234 |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634028 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | -- | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A8960 | |
| 维甲酸 | Sigma | R2625 | |
| Y27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | Selleck Chemicals | S1067 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子2 | PeproTech | 100-18B | |
| 成纤维细胞生长培养基3 | PromoCell | C-23025 | |
| 转化生长因子β1 | R&D | 240-B-010 | |
| RPMI+B27不含胰岛素 | -- | -- | |
| B27补充剂 | Gibco | 17504044 | |
| EGM2培养基 | Lonza | -- | |
| 血管内皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| 骨形态发生蛋白4 | PeproTech | -- | |
| TrypLE | -- | -- | |
| CD144偶联磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| I型胶原 | -- | -- | |
| PDMS水凝胶 | Sigma | 5190 | |
| FluoroBrite DMEM | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 水凝胶合成 | 四臂PEG-磺基-BCN | -- | -- |
| 含叠氮基团的八臂PEG大分子单体 | -- | -- | |
| 层粘连蛋白 | -- | -- | |
| 纤连蛋白 | -- | -- | |
| PEG-叠氮化物 | -- | -- | |
| 药物处理 | saracatinib | -- | -- |
| 吡非尼酮 | -- | -- | |
| blebbistatin | -- | -- | |
| 维替泊芬 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 免疫荧光 | αSMA抗体 | Abcam | ab7817 |
| YAP1抗体 | Novus Biologicals | NB110-58358 | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| MRTF-A/MKL1抗体 | Novus Biologicals | NBP2-45862 | |
| SORBS/ArgBP2抗体 | Proteintech | 83189-3-RR | |
| Alexa Fluor二抗 | Invitrogen | -- | |
| DAPI | Thermo | R37606 | |
| 鬼笔环肽 | Thermo | A22287 | |
| 免疫印迹 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo | 78441 |
| NuPage LDS缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Invitrogen | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- | |
| Bio-Rad Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | 1704272 | |
| αSMA一抗 | Abcam | ab7817 | |
| Col-I抗体 | Novus Biologicals | NBP1-30054 | |
| POSTN抗体 | Abcam | ab14041 | |
| YAP1抗体 | Proteintech | 66900-1-Ig | |
| 磷酸化YAP1抗体 | Cell Signaling | 4911 | |
| SRC抗体 | Proteintech | 60315-1-Ig | |
| 磷酸化SRC抗体 | Cell Signaling | 2101 | |
| GAPDH抗体 | Thermo | MA5-15738-HRP | |
| 抗小鼠HRP偶联IgG | Cell Signaling | 7076 | |
| 抗兔HRP偶联IgG | Cell Signaling | 7074 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫共沉淀 | Pierce Classic磁性IP/Co-IP试剂盒 | Thermo | -- |
| MRTF-A抗体 | Cell Signaling | 77098 | |
| 正常兔IgG | Cell Signaling | 2729 | |
| 质谱分析 | timsTOF Ultra | Bruker Daltonics | -- |
| nanoElute 2 | Bruker Daltonics | -- | |
| PepSep Ultra C18色谱柱 | Bruker Daltonics | P/N | |
| 胰蛋白酶/LysC混合物 | Promega | -- | |
| MonoSpin C18固相萃取柱 | GL Sciences | -- | |
| 细胞转染 | JetPrime转染试剂 | -- | -- |
| MRTF-A-tdTomato构建体 | Twist Biosciences | -- | |
| siRNA敲低 | siSORBS | Thermo Scientific | s16087 |
| siCTRL | Thermo Scientific | 4390843 | |
| Seahorse分析 | Seahorse线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- |
| Agilent Seahorse XF RPMI基础培养基 | Agilent | -- | |
| EHT | 特氟龙垫片 | EHT Technologies | C0002 |
| EHT硅胶支架 | EHT Technologies | C0001 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Scientific | 11875119 | |
| 抑肽酶 | Sigma-Aldrich | A1153 | |
| 牛纤维蛋白原 | Sigma-Aldrich | F8630 | |
| 生长因子减少的基质胶 | Corning | 356231 | |
| 凝血酶 | Sigma-Aldrich | T6634 | |
| 动物实验 | saracatinib | -- | -- |
| 吡非尼酮 | -- | -- | |
| 组织学 | 马森三色染色 | Sigma-Aldrich | -- |
| 超声心动图 | Vevo2100超声系统 | Visual Sonics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iPSC-CF分化与培养 | iPSC-CFs的分化方案（CHIR99021、IWR1、FGF2、SB431542等处理顺序和时间）、基质硬度（0.1-64 kPa及刚性塑料）、培养代数（约10代） 阅读提示：Materials and Methods: Differentiation of iPSC-derived cardiac fibroblasts |
| 基质软化实验 | 动态软化水凝胶的制备（PEG浓度、光触发条件，365 nm光强度和时间）、细胞接种密度（25k cells/well）、TGFβi浓度（5 μM SB431542） 阅读提示：Materials and Methods: Dynamically softening biomaterials; Figure 2 legend |
| scRNA-seq和snRNA-seq | 细胞/核制备方法、10X Genomics平台、参考基因组（human GRCh38, mouse mm10）、细胞过滤阈值（基因数200-6000，线粒体基因<20%）、聚类参数（前30个PC） 阅读提示：Materials and Methods: Single-cell and single-nucleus RNA sequencing |
| 药物处理 | saracatinib浓度（体内20 mg/kg，体外1 μM）、pirfenidone浓度（体内200 mg/kg，体外未明确）、SB431542浓度（5 μM）、处理时长（2天、7天） 阅读提示：Materials and Methods: TAC和MI模型；Extended Data Figure 6 legend |
| 动物模型 | 小鼠品系（C56BL/6N，雄性，8-10周龄）、TAC手术方法（27G针头结扎）、MI手术方法（LAD结扎）、药物给药方式（口服，每日一次） 阅读提示：Materials and Methods: Transverse aortic constriction (TAC) and myocardial infarction (MI) models |
| EHT制造 | EHT中细胞比例（93% iPSC-CMs, 7% iPSC-CFs）、细胞密度（2×10^7 cells/mL）、基质成分（7 mg/mL fibrinogen, 5% Matrigel） 阅读提示：Materials and Methods: Engineered heart tissue fabrication and analysis |