验证RAS突变作为晚期事件的必要性
确定RAS突变必须在其他致癌突变之后获得才能诱导白血病。
通过CRISPR-Cas9编辑iPS细胞产生单、双、三突变，并移植到NSG小鼠观察植入；使用iPS细胞和脐带血CD34+细胞，通过慢病毒和Dox诱导系统在不同时间点引入NRASG12D，然后移植评估白血病发生。
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RAS突变白血病干细胞驱动对维奈克拉的临床耐药
RAS-mutant leukaemia stem cells drive clinical resistance to venetoclax
实验完整度
高包含基因编辑iPS细胞和原代HSPC的体外及移植模型、单细胞转录组和ATAC-seq等多组学分析、患者队列和临床试验数据，以及体内药物处理实验，证据层级丰富（至少两个独立层级如体外模型、动物模型、患者样本）。
主要模型
人iPS细胞来源的造血干细胞和祖细胞（iPS-HSPCs） 脐带血CD34+ HSPCs 患者来源的AML iPS细胞系（如AML-4.10、AML-4.24） NSG/NSGS小鼠移植模型
重点核对
NRASG12D突变的获得顺序：在SRSF2和ASXL1突变之前或同时获得时不能诱导白血病，仅在之后获得时才能诱导。 GMP是RAS突变LSC的起源细胞，而非CMP或更原始的HSPC。 RAS突变LSC对维奈克拉耐药，而RAS野生型LSC敏感，耐药与BCL2表达降低和MCL1/BCL-xL表达升高相关。 维奈克拉治疗在体内加速RAS突变白血病进展。
摘要
癌症驱动突变通常表现出不同的时间获得模式，但其生物学基础（如果有的话）仍然未知。在急性髓系白血病中，RAS突变几乎总是在病程晚期出现，即在进展或复发/难治性疾病时出现1–6。在这里，通过使用人类白血病发生模型，我们首先证明RAS突变是必须晚于早期合作突变发生的强制性晚期事件。我们对此的机制解释是，突变RAS特异性转化携带先前获得驱动突变的髓单核细胞谱系定向祖细胞（粒-单核细胞祖细胞），表明晚期白血病克隆可能起源于造血层级中与祖先克隆不同的细胞类型。此外，我们证明RAS突变白血病干细胞（LSC）产生单核细胞疾病，正如在BCL2抑制剂维奈克拉治疗反应差的患者中经常观察到的那样。我们表明，这是因为RAS突变LSC与RAS野生型LSC相比，具有改变的BCL2家族基因表达并对维奈克拉耐药，从而驱动临床耐药和以单核细胞特征为特征的复发。我们的发现表明，特定的遗传驱动因子通过施加特定的LSC靶细胞限制来塑造急性髓系白血病的非遗传细胞层级，并严重影响患者的治疗结果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RAS突变在急性髓系白血病中通常晚期出现，其生物学基础以及对临床结局的影响是什么？
- 核心机制
- 突变RAS通过靶向携带先前驱动突变的粒-单核细胞祖细胞（GMP）进行转化，产生具有单核细胞分化特征的白血病干细胞（LSC），这些LSC通过下调BCL2并上调MCL1和BCL-xL而对维奈克拉耐药，从而驱动临床耐药和复发。
- 主要证据
- 通过CRISPR-Cas9编辑iPS细胞和原代脐带血细胞证实RAS突变作为晚期事件在GMP中诱导白血病；单细胞转录组和ATAC-seq显示RAS突变LSC具有GMP样特征并产生单核细胞；患者来源iPS细胞和临床队列分析显示RAS突变与单核细胞分化和维奈克拉耐药相关。
- 研究意义
- 该研究发现了一个新的范例，即特定癌基因驱动因子通过选择特定的靶细胞类型（GMP）来塑造AML的细胞层级，并决定对靶向治疗的敏感性，为将维奈克拉与MCL1抑制剂或RAS抑制剂联合治疗RAS突变患者提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定RAS突变LSC的起源细胞为GMP
确定RAS突变转化的靶细胞类型。
通过流式细胞术和单细胞RNA测序分析不同转导组的CB HSPCs中免疫表型群体；通过FACS分选SA+R的CMP和GMP并移植，评估白血病起始能力；通过bulk RNA-seq和ATAC-seq比较早期和晚期RAS的iPS-HSPCs的转录和染色质状态。
证明RAS突变LSC产生单核细胞白血病
验证RAS突变亚克隆是否产生成熟单核细胞表型。
使用来自同一患者的一对AML iPS细胞系（RAS野生型AML-4.24和RAS突变型AML-4.10）异种移植后单细胞RNA-seq分析免疫表型；对原发AML样本进行Genotyping of Transcriptomes（GoT）分析；在患者队列中分析RAS突变与单核细胞形态的关联。
评估RAS突变LSC对维奈克拉的敏感性
确定RAS突变状态是否影响LSC对维奈克拉的敏感性。
对iPS细胞来源的HSPCs和单核细胞、以及患者来源AML iPS细胞来源的LSC进行维奈克拉处理，测定细胞活力；对移植SA+R CB细胞的NSGS小鼠给予维奈克拉或载体，比较生存期；通过单细胞转录组分析BCL2家族基因表达。
区分GMP状态与RAS突变对维奈克拉耐药的作用
确定耐药是由RAS突变本身而不是GMP细胞状态引起。
对FACS分选的SA+R CMP和GMP进行bulk和scRNA-seq分析BCL2家族基因表达；比较CMP和GMP对维奈克拉的敏感性；在GMP中比较NRASG12D+和野生型细胞的基因表达；在患者来源AML iPS细胞LSC中异位表达NRASG12D或KRASG12D，检测维奈克拉敏感性和BCL2家族蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建小鼠模型
基因编辑
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和造血分化 | StemPro-34无血清培养基 | -- | -- |
| BIT 9500血清替代物 | Stem Cell Technologies | -- | |
| X-VIVO 15培养基 | -- | -- | |
| StemPro-34无血清培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | 维奈克拉 | Selleckchem | -- |
| RAS抑制剂 | Chemed | C-1418 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| 蛋白质印迹 | BCL2抗体 | DAKO | M0887 |
| MCL1抗体 | Cell Signaling Technologies | 5453S | |
| BCL-xL抗体 | Cell Signaling Technologies | 2764S | |
| 流式细胞术 | CD34-PE抗体 | BD Pharmingen | 550761 |
| 细胞分选 | MACS CD45微珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 |
| 小鼠细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| RNA提取 | RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA测序 | NEBNext Poly(A) mRNA磁珠分离模块 | New England Biolabs | -- |
| NEXTflex快速定向RNA-seq文库制备试剂盒 | Bioo Scientific | -- | |
| ATAC-seq | Nextera DNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 造血干细胞和祖细胞培养与转导 | CB CD34+细胞的来源：AllCells；培养基组成：X-VIVO 15 + 1%非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM β-巯基乙醇、20% BIT 9500、100ng/ml SCF、100ng/ml Flt3配体、100ng/ml TPO、20ng/ml IL-3；转导时间：培养1-4天；polybrene浓度：4μg/ml。 阅读提示：Methods: iPS- and CB-derived HSPC culture and lentiviral transduction |
| 小鼠移植模型 | 小鼠品系：NSG或NSGS；年龄：6-8周雌性；预处理：30mg/kg白消安腹腔注射；细胞注射量：iPS来源细胞1×10^6，CB来源细胞2-3×10^5；注射体积100μl尾静脉。 阅读提示：Methods: Transplantation into NSG and NSGS mice |
| 维奈克拉体内给药 | 给药方式：口服灌胃；剂量：100mg/kg/天；给药时间：移植后1周开始，持续3周；配方：60% phosal 50 propylene glycol, 30% polyethylene glycol 400, 10% ethanol。 阅读提示：Methods: Transplantation into NSG and NSGS mice; Figure 4 legend |
| 维奈克拉体外敏感实验 | 细胞密度：20000细胞/孔（96孔板）；维奈克拉浓度：6μM；处理时间：3天；检测方法：CellTiter-Glo；对照组：DMSO。 阅读提示：Methods: VEN treatment and viability assay |