构建可控的ecDNA生成系统
验证利用Cre-loxP系统在基因组中生成ecDNA的可行性并建立双荧光报告系统。
设计两个circularization cassettes插入到目标区域两侧，经Cre重组产生ecDNA并重建H2B-GFP表达，同时线性染色体保留mScarlet表达。在HCT116细胞中通过CRISPR-Cas9敲入cassettes，生成ecMDM2和invMDM2对照细胞系。
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工程化的染色体外癌基因扩增促进肿瘤发生
Engineered extrachromosomal oncogene amplifications promote tumorigenesis
实验完整度
高涵盖细胞系建模（HCT116）、多种原代细胞（aNSC、MEF、肝细胞）、体外功能验证（增殖、永生化、转化）、体内自发性肝癌模型及分子分析（sWGS、RNA-seq、FISH、ATAC-seq），包含功能验证和机制验证。
主要模型
HCT116细胞系 小鼠成年神经干细胞（aNSC） 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 自发性肝癌小鼠模型
重点核对
Cre重组酶介导的loxP位点重组效率（文中未明确给出具体数值） ecDNA形成和扩增的动态监测（GFP和mScarlet双荧光标记） ecDNA拷贝数与GFP强度的正相关性 体外选择性压力（潮霉素）对ecDNA积累的影响 体内肿瘤形成需要额外的致癌事件（如HRASG12V或MYC）
摘要
局灶性基因扩增是最常见的癌症相关突变之一，但已被证明难以在原代细胞和模式生物中进行工程化。在这里，我们描述了一种通用策略，通过染色体外DNA（ecDNA）在细胞和小鼠中以时空可控的方式工程化大（超过1 Mbp）的局灶性扩增。通过将ecDNA形成与选择性标记物的表达偶联，我们跟踪了生理条件下以及在特定选择性压力下含ecDNA细胞的动态。我们还应用这种方法生成了携带Cre诱导的、类似于人类癌症中发生的Myc和Mdm2 ecDNA的小鼠。我们证明，工程化的ecDNA自发地在源自这些动物的原代细胞中积累，促进其增殖、永生化并转化。最后，我们证明了携带Mdm2的ecDNA在自发性小鼠肝细胞癌模型中促进肿瘤形成的能力。这些发现为ecDNA介导的基因扩增在肿瘤发生中的作用提供了见解。我们预计这种方法将有助于研究ecDNA生物学中尚未解决的方面，并为开发携带特定局灶性基因扩增的人类癌症的新临床前免疫活性小鼠模型提供价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何精确地在原代细胞和体内工程化染色体外DNA（ecDNA）介导的局灶性基因扩增，以及这些扩增如何促进肿瘤发生？
- 核心机制
- ecDNA通过随机分离实现快速拷贝数增加，驱动癌基因高表达，并通过MDM2抑制p53通路或通过MYC激活下游靶基因，进而促进细胞增殖、永生化、转化和肿瘤形成。
- 主要证据
- 在HCT116细胞中通过CRISPR-Cas9和Cre-loxP系统生成ecMDM2和invMDM2细胞系，验证了ecDNA的形成和动态；在小鼠中工程化Myc和Mdm2 ecDNA，在aNSC和MEF中观察到ecDNA积累和表型变化；体内模型证明Mdm2 ecDNA与MYC协同促进肝癌形成。
- 研究意义
- 该研究提供了一种通用的ecDNA工程化策略，为研究ecDNA生物学和开发携带特定局灶性扩增的人类癌症临床前模型提供了工具，并揭示了ecDNA在肿瘤发生中的直接作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ecDNA的形成和扩增
确认ecDNA的生成以及其动态变化。
通过流式分选双阳性细胞，制备中期染色体涂片，用FISH和定量PCR验证ecDNA的存在和MDM2拷贝数变化；通过浅全基因组测序（sWGS）确认扩增区域。
在多种原代细胞中生成ecDNA
评估该策略在原代细胞中的普适性并观察ecDNA的自发积累。
从Mycec/+p53fl/fl小鼠中分离aNSC、MEF、小脑干细胞和肝细胞，用AdCre感染，培养数周，通过FISH、sWGS和RNA-seq检测ecDNA形成和基因表达。
验证ecDNA的致癌潜力
探究Mdm2 ecDNA是否促进细胞永生化、转化及肿瘤形成。
用Mdm2ec/+ MEF，感染AdCre后观察永生化现象；转导HRASG12V后移植到裸鼠体内观察肿瘤形成；在体内用Actin-Cre介导Mdm2ec等位基因环化，并结合MYC转座子通过尾静脉注射诱导肝癌。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | Cas9蛋白 | Integrated DNA Technologies | -- |
| crRNA | Integrated DNA Technologies | -- | |
| tracrRNA | Integrated DNA Technologies | -- | |
| 转染 | 脂质体转染试剂3000 | Thermo Fisher | L3000008 |
| 脂质体CRISPR转染试剂 | Thermo Fisher | CMAX00008 | |
| 病毒感染 | 表达Cre的重组腺病毒 | ViraQuest | VQ-Ad-CMV-Cre; |
| Ad5CAGCre重组腺病毒 | University of Iowa | VVC-U | |
| 细胞培养 | McCoy's 5A改良培养基 | Thermo Fisher Scientific | 16600108 |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| 青霉素-链霉素 | Gemini Bio-Products | 400-109 | |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P9620 |
| 潮霉素B | Thermo Fisher Scientific | 10687010 | |
| 细胞培养 | 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 |
| 神经干细胞基础培养基 | Stem Cells Technologies | 05702 | |
| 表皮生长因子 | Stem Cells Technologies | 78006 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Stem Cells Technologies | 78003 | |
| 肝素 | Stem Cell Technologies | 07980 | |
| 细胞分离 | 木瓜蛋白酶解离系统 | Worthington | LK003150 |
| 肝细胞分离 | 分散酶II | Roche | 04942078001 |
| 胶原酶IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 肝细胞培养 | William's E培养基 | Gibco | A1217601 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 | Gibco | 41-400-045 | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | COEDTAF-RO |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | PHOSS-RO | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1704271 | |
| LICOR Intercept封闭缓冲液 | LICOR | -- | |
| 抗Vinculin抗体 | Millipore | MAB3574 | |
| 抗c-MYC抗体 | Cell Signaling | D84C12 | |
| 抗MDM2抗体 | Cell Signaling | 51541 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling | 3873 | |
| 抗p53抗体 | Leica Biosystems | P53-PROTEIN-CM5 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling | 64016 | |
| IRDye 800抗兔二抗 | LICOR | 926-32213 | |
| IRDye 680抗小鼠二抗 | LICOR | 926-68072 | |
| Odyssey成像系统 | LICOR | -- | |
| 流式细胞术 | DAPI | Thermo Scientific | D1306 |
| LSR Fortessa流式细胞分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSAria流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSymphony流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 组织处理 | Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64110-04 |
| 过氧化氢 | MP Biomedicals | 194057 | |
| 免疫组化 | 柠檬酸基抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300 |
| 抗HNF4α抗体 | CST | 3113T | |
| 抗CK19抗体 | Abcam | AB52625 | |
| VectaStain ABC-HRP兔IgG试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| ImmPACT DAB显色液 | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| VectaMount Express封片剂 | Vector Laboratories | H-5700 | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74106 |
| DNA酶I（Ambion） | Ambion | AM2222 | |
| 逆转录 | SuperScript IV第一链合成系统 | Invitrogen | 18091050 |
| qPCR | PowerUp SYBR Green | Applied Biosystems | A25777 |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 药物处理 | 米拉德美坦 | MedChemExpress | HY-101266 |
| 细胞活力 | Cell-TiterGlo活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| Synergy 2酶标仪 | Biotek | -- | |
| 基因拷贝数分析 | TaqMan拷贝数检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Mm00734221_cn, |
| TaqPath ProAmp预混液 | Applied Biosystems | A30865 | |
| TaqMan拷贝数参考检测 | Applied Biosystems | 4458367 | |
| 数字PCR | QX200微滴数字PCR系统 | Bio-Rad | 1864001 |
| QuantaSoft软件 | Bio-Rad | v.1.7 | |
| 测序 | LE220-plus聚焦超声破碎仪 | Covaris | 500560 |
| KAPA Hyper Prep建库试剂盒 | Kapa Biosystems | KK8504 | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000 S4试剂盒v1.5（200循环） | Illumina | -- | |
| 中期染色体涂片 | KaryoMAX | Thermo Fisher Scientific | 15212012 |
| FISH | MDM2绿色FISH探针 | Empire Genomics | SKU |
| 着丝粒对照探针 | Empire Genomics | -- | |
| BAC克隆RP23-130M7 | Roswell Park Cancer Institute Genomics Shared Resource | -- | |
| BAC克隆RP23-342F3 | Roswell Park Cancer Institute Genomics Shared Resource | -- | |
| BAC克隆RP23-454G15 | Roswell Park Cancer Institute Genomics Shared Resource | -- | |
| BAC克隆RP23-333G9 | Roswell Park Cancer Institute Genomics Shared Resource | -- | |
| BAC克隆RP23-307D14-橙 | Empire Genomics | -- | |
| BAC克隆RP23-428D5 | BACPAC | -- | |
| BAC克隆RP23-309H16 | BACPAC | -- | |
| NucleoBond Xtra BAC提取试剂盒 | Takara | 740436 | |
| ChromaTide Alexa Fluor 568-5-dUTP | Thermo | C11399 | |
| ChromaTide Alexa Fluor 488-5-dUTP | Thermo | C11397 | |
| 小鼠COT-1 DNA | -- | -- | |
| Prolong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo | P36965 | |
| RNA原位杂交 | Mdm2 RNAscope探针 | Advanced Cell Diagnostics (ACD) | 447648 |
| PPIB RNAscope探针 | Advanced Cell Diagnostics (ACD) | 313918 | |
| dapB RNAscope探针 | Advanced Cell Diagnostics (ACD) | 312038 | |
| RNAscope 2.5 LS试剂盒-棕色 | Advanced Cell Diagnostics (ACD) | 322100 | |
| CF594/酪酰胺 | Biotium | B40953 | |
| Leica Bond RX自动染色仪 | Leica | -- | |
| Bond脱蜡液 | Leica | AR9222 | |
| EDTA抗原修复液ER2 | Leica | AR9640 | |
| 小鼠品系 | Actin-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | 019099 |
| Vil1-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | 021504 | |
| Atoh1-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | 011104 | |
| Alb-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | 003574 | |
| Mx1-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | 003556 | |
| Nestin-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | -- | |
| p53fl小鼠 | Jackson Laboratory | 008462 | |
| 无胸腺裸鼠 | Jackson Laboratory | 007850 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ecDNA生成系统 | Cre重组酶的表达方式（AdCre滴度）和loxP位点的插入效率；circularization cassettes的序列和插入位置 阅读提示：Methods: Plasmids and viral vectors; Homologous recombination in HCT116 cells; Supplementary Fig. 1 |
| 细胞培养条件 | 培养基成分（如DMEM、FBS浓度）、细胞培养密度、传代次数 阅读提示：Methods: Cell culture |
| ecDNA检测 | 中期染色体涂片制备步骤（KaryoMAX浓度和处理时间）、FISH探针序列和标记方法 阅读提示：Methods: Metaphase chromosome spread analysis; FISH analysis |
| 功能验证 | 细胞增殖或永生化检测的时间点、HRASG12V转导方法和剂量、裸鼠注射细胞数和监测频率 阅读提示：Methods: In vivo tumorigenesis; Cell culture; Results对应段落 |
| 体内模型 | 肝肿瘤模型中MYC转座子和转座酶的注射剂量和体积、小鼠品系及性别、肿瘤发展监测时间 阅读提示：Methods: Animals; 结果中“Engineered ecDNAs promote tumorigenesis”部分 |