构建多模态胸腺细胞图谱
整合单细胞和空间数据，以覆盖发育过程中的细胞异质性
整合了已发表的scRNA-seq数据和自产的CITE-seq、strome-enriched scRNA-seq、Visium空间转录组和IBEX成像数据，跨越胎儿（p.c.w. 11-21）和儿科（新生儿至3岁）阶段。
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映射到连续组织轴的人类胸腺空间细胞图谱
A spatial human thymus cell atlas mapped to a continuous tissue axis
实验完整度
高研究整合了多模态单细胞图谱、Visium空间转录组、IBEX多重成像和RNAscope验证等独立证据层级，并进行了功能验证和机制推断。
主要模型
胎儿胸腺组织（p.c.w. 11-21） 儿科胸腺组织（新生儿至3岁） 胎儿和儿科胸腺单细胞图谱 儿科胸腺IBEX多重成像样本
重点核对
CMA参数设置：r=15μm, K=10 Visium样本的年龄分布（胎儿p.c.w. 11-21，儿科新生儿至3岁） IBEX核分割的细胞数量（8个样本，共1,101,631个核） CITE-seq抗体panel的使用及数据质量过滤条件
摘要
T 细胞由循环前体细胞发育而来，这些细胞进入胸腺并穿过支持其成熟和选择的特化亚区。在人类中，这一过程始于早期胎儿发育，并在青春期胸腺退化前保持高度活跃。为了描绘这一过程在出生前和出生后早期的微解剖基础，我们建立了一个胸腺定量形态学框架——皮质-髓质轴，并将其用于空间分辨分析。在此，通过将该框架应用于精选的多模态单细胞图谱、空间转录组学和高分辨率多重成像数据，我们证明在胎儿发育第二个三个月开始时，小叶细胞因子网络、经典胸腺细胞轨迹和胸腺上皮细胞分布已经建立。我们精确定位了胸腺上皮细胞祖细胞的组织生态位以及与胸腺小体相关的不同亚型，并鉴定了 CD4 和 CD8 T 细胞谱系之间进入髓质时间的差异。这些发现为详细理解 T 淋巴细胞发育提供了基础，并辅以一个用于跨平台成像数据分析、注释和 OrganAxis 构建的整体工具包（TissueTag），该工具包可应用于任何组织。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类胸腺在不同发育阶段（胎儿和儿科）的细胞类型空间组织如何，以及如何通过一个连续坐标框架（CMA）进行定量比较？
- 核心机制
- 胸腺微环境的细胞因子/趋化因子梯度和典型T细胞成熟轨迹在妊娠中期开始时已建立；CD4和CD8 T细胞谱系经历皮质-髓质迁移的时间存在差异，可能受到趋化因子受体CCR4和CXCR3差异表达的影响。
- 主要证据
- 通过整合scRNA-seq、Visium空间转录组、IBEX成像和RNAscope验证，在胎儿和儿科胸腺中绘制了TEC亚型和T细胞发育轨迹的空间分布，并发现mcTEC在胎儿和儿科中的定位差异。
- 研究意义
- 该研究提供了胸腺衰老和退化的图谱化策略，可能有助于组织工程和胸腺病理（如重症肌无力、唐氏综合征、DiGeorge综合征等）的理解，并提出了可适用于任何组织的TissueTag和OrganAxis框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立皮质-髓质轴（CMA）作为通用坐标框架
为胸腺组织提供尺度不变和旋转不变的连续坐标，以便跨样本和跨模态比较
使用TissueTag对H&E图像进行注释，基于到皮层、髓质和边缘的距离定义CMA，并将CMA值映射到Visium点和IBEX细胞。
绘制T细胞发育轨迹的空间分布
确定不同分化阶段T细胞在CMA上的位置
利用单细胞参考对Visium斑点进行去卷积，并将T细胞亚型映射到CMA bins，比较胎儿和儿科胸腺。
分析细胞因子和趋化因子表达模式
研究驱动T细胞迁移的趋化因子/细胞因子在CMA上的分布及其发育保守性
基于Visium数据，对65种细胞因子/趋化因子在CMA bins的分布进行层次聚类，并计算胎儿与儿科之间的余弦相似性和ANOVA交互效应。
绘制胸腺上皮细胞（TEC）亚型空间分布
绘制TEC亚型在胎儿和儿科胸腺中的位置，并鉴定假定的祖细胞生态位
整合TEC富集的scRNA-seq数据，通过Visium去卷积映射TEC亚型，并使用IBEX成像和RNAscope验证关键亚型。
研究TEC亚型与胸腺小体（HC）的关联
确定哪些细胞类型与HC相关，并分析mTEC亚型沿HC距离的分布
使用TissueTag注释HC，计算Visium点到最近HC的距离，分析去卷积细胞和特殊基因（SG）的分布，并进行mTECII/III轨迹分析。
高分辨率映射SP胸腺细胞并分析迁移时间
以高分辨率确定CD4和CD8谱系胸腺细胞皮质-髓质迁移的时间差异
使用CITE-seq数据高分辨率聚类并映射到paediatric Visium，通过IBEX验证，并分析趋化因子受体表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和分离 | HypoThermosol保存液 | Sigma-Aldrich | H4416-100ML |
| 组织消化 | Liberase TH | Roche | 05401135001 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 4716728001 | |
| 细胞分离 | 红细胞裂解液 | eBioscience | 00-4333-57 |
| 细胞分选 | CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 |
| CD326 (EPCAM) 磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-061-101 | |
| CD3磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| 流式分选 | 抗CD326 PE抗体 | BioLegend | 324206 |
| 抗CD45 BV785抗体 | BioLegend | 304048 | |
| 抗CD205 APC抗体 | BioLegend | 342207 | |
| 抗CD3 FITC抗体 | BioLegend | 317306 | |
| 单细胞测序 | Chromium Next GEM 单细胞5'试剂盒v2 | 10x Genomics | 1000263 |
| 文库构建试剂盒 | 10x Genomics | 1000190 | |
| TCR测序 | Chromium 单细胞人类TCR扩增试剂盒 | 10x Genomics | 1000252 |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 组织处理 | Tissue-Tek包埋模具 | Tissue-Tek | AGG4581 |
| 组织包埋 | OCT包埋剂 | Leica Biosystems | 14020108926 |
| 组织切片 | 冷冻切片机 | Leica | -- |
| CM1950冷冻切片机 | Leica | -- | |
| CM3050S冷冻切片机 | Leica | -- | |
| Visium空间转录组 | Visium空间基因表达玻片和试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000184 |
| 成像 | Hamamatsu Nanozoomer 2.0 HT切片扫描仪 | Hamamatsu | -- |
| IBEX成像 | BD CytoFix/CytoPerm固定破膜剂 | BD Biosciences | -- |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 人Fc阻断剂 | BD Biosciences | -- | |
| Hoechst 33342染料 | Biotium | -- | |
| Fluoromount G封片剂 | Southern Biotech | -- | |
| Leica TCS SP8 X共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| RareCyte成像 | RM2235切片机 | Leica | -- |
| Superfrost载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 12312148 | |
| Image-iT FX信号增强剂 | Thermo Fisher Scientific | I36933 | |
| RareCyte Orion显微镜 | RareCyte | -- | |
| RNAscope | RNAscope LS多重荧光试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics (ACD), Bio-Techne | -- |
| RNAscope LS 4-Plex辅助试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics (ACD), Bio-Techne | -- | |
| RNAscope LS 2.5 4-plex阳性对照探针 | ACD Bio-Techne | 321808 | |
| RNAscope 4-plex LS多重阴性对照探针 | ACD Bio-Techne | 321838 | |
| Opal 520荧光染料 | Akoya Biosciences | -- | |
| Atto 425-链霉亲和素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Hs-AIRE探针 | ACD Bio-Techne | 551248 | |
| Hs-LY75-C2探针 | ACD Bio-Techne | 481438-C2 | |
| Hs-CAMP-C3探针 | ACD Bio-Techne | 446248-C3 | |
| Hs-EPCAM-C4探针 | ACD Bio-Techne | 310288-C4 | |
| Hs-IGFBP6-C1探针 | ACD Bio-Techne | 496068 | |
| Hs-DLK2-C3探针 | ACD Bio-Techne | 425088-C3 | |
| DAPI染色液 | Life Technologies | D1306 | |
| Perkin Elmer Operetta CLS高内涵分析系统 | Perkin Elmer | -- | |
| CITE-seq | 胶原酶 | Gibco | 17104-019 |
| IMDM培养基 | -- | -- | |
| TotalSeq-C人类通用抗体混合物1.0 | BioLegend | 399905 | |
| 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi | 130-090-101 | |
| LS柱 | Miltenyi | 130-122-729 | |
| 人类TruStain FcX阻断液 | BioLegend | 422301 | |
| 抗CD3-PE抗体 | BioLegend | 344805 | |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | 230111 | |
| BD FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| Next GEM单细胞5'试剂盒v2 | 10x Genomics | 1000265 | |
| Chip K微流控芯片 | 10x Genomics | 1000286 | |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| BioRad C1000 Touch热循环仪 | BioRad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞图谱构建 | 样本年龄、来源、细胞富集策略、scRNA-seq平台、数据整合方法 阅读提示：Methods: Data generation; Sample processing; scRNA-seq quality control, data integration and annotation |
| Visium空间转录组 | 组织处理、包埋、切片厚度、透化时间、测序深度、样本数量 阅读提示：Methods: 10x Visium spatial transcriptomics sample processing and sequencing |
| IBEX成像 | 抗体panel组成、固定方法、切片厚度、成像参数、分割软件及参数 阅读提示：Methods: IBEX clinical cohort details; IBEX sample imaging preparation; IBEX image acquisition and alignment |
| CITE-seq | 抗体panel、细胞染色浓度、流式分选参数、文库制备和测序设置 阅读提示：Methods: CITE-seq sample preparation; CITE-seq antibody preparation; CITE-seq library preparation and sequencing |
| 数据整合和分析 | 批次校正方法、细胞注释策略、轨迹分析方法、统计检验 阅读提示：Methods: scRNA-seq quality control, data integration and annotation; CITE-seq annotation; mTEC trajectory analysis; mcTEC differentiation potential analysis |