建立饮食诱导肥胖模型并评估肿瘤生长和抗PD-1反应
验证高脂饮食是否影响肿瘤生长及抗PD-1治疗的疗效。
将C57BL/6J小鼠喂食低脂饮食（10% kcal）或高脂饮食（45% kcal）20-25周，皮下注射MC38结肠癌细胞，肿瘤生长19天后给予抗PD-1或IgG对照，测量肿瘤生长和体重。
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肥胖诱导巨噬细胞上的PD-1抑制抗肿瘤免疫
Obesity induces PD-1 on macrophages to suppress anti-tumour immunity
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内肿瘤模型、单细胞测序和临床样本分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证（如敲除、抑制剂、代谢分析）
主要模型
小鼠MC38结肠癌同系皮下移植模型 小鼠6419c5胰腺癌模型 小鼠LVRCC肾癌模型 人肾透明细胞癌肿瘤样本 人子宫内膜癌肿瘤样本
重点核对
使用45 kcal%高脂饮食或10 kcal%低脂饮食喂养20-25周诱导肥胖 皮下注射5×10^5 MC38细胞，肿瘤生长19天 抗PD-1（RMP1-14）或IgG对照在肿瘤可触及后第9、11、13、15天腹腔注射200 μg 骨髓来源巨噬细胞用IFNγ（50 ng/ml）或IL-4（50 ng/ml）或25%肿瘤条件培养基刺激24小时 LysMCre Pdcd1fl/fl小鼠用于髓系特异性PD-1敲除
摘要
肥胖是许多癌症进展和转移的主要风险因素，但在某些情况下可提高生存率和对免疫检查点阻断疗法（包括靶向PD-1的抗PD-1疗法）的反应。尽管肥胖促进慢性炎症，但免疫系统在肥胖与癌症联系及免疫治疗中的作用仍不清楚。已证明除T细胞外，巨噬细胞也能表达PD-1。我们研究发现肥胖选择性诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAM）上的PD-1表达。与肥胖相关的I型炎症细胞因子和分子，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子、瘦素、胰岛素和棕榈酸酯，以mTORC1和糖酵解依赖的方式诱导巨噬细胞PD-1表达。PD-1随后向TAM提供负反馈，抑制糖酵解、吞噬作用和T细胞刺激潜能。相反，PD-1阻断增加了巨噬细胞糖酵解水平，这对于PD-1抑制增强TAM表达CD86和主要组织相容性复合体I和II类分子以及激活T细胞的能力至关重要。髓系特异性PD-1缺陷减缓了肿瘤生长，增强了TAM糖酵解和抗原呈递能力，并导致CD8+ T细胞活性增加，耗竭标志物水平降低。这些发现表明，肥胖相关的代谢信号和炎症线索导致TAM诱导PD-1表达，进而驱动TAM特异性反馈机制，损害肿瘤免疫监视。这可能有助于解释肥胖中癌症风险增加但PD-1免疫治疗反应改善的现象。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肥胖如何影响肿瘤相关巨噬细胞的PD-1表达及其在抗肿瘤免疫和免疫治疗反应中的作用？
- 核心机制
- 肥胖相关的炎症因子和代谢物通过mTORC1和糖酵解途径诱导TAM上的PD-1表达，PD-1随后反馈抑制TAM的糖酵解、吞噬作用和抗原呈递能力，从而抑制抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 通过DIO小鼠模型、scRNA-seq、流式细胞术、细胞外通量分析、临床试验样本和髓系特异性敲除小鼠，证明PD-1在TAM上的表达受肥胖诱导，且PD-1阻断或敲除可恢复TAM功能并增强CD8+ T细胞活性。
- 研究意义
- 揭示了PD-1作为TAM代谢调节剂的新机制，为肥胖相关癌症风险和免疫治疗反应提供了可能的解释，并为联合治疗策略提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析肿瘤免疫微环境
比较不同饮食和处理组肿瘤中免疫细胞组成和基因表达差异。
从MC38肿瘤中分离CD45+和CD45−细胞进行scRNA-seq，鉴定免疫细胞亚群并分析基因表达，同时进行V(D)J测序分析TCR克隆性，并用Compass分析代谢状态。
表征肥胖对TAM功能的影响
确定高脂饮食是否改变肿瘤相关巨噬细胞的吞噬、抗原呈递和代谢表型。
通过流式细胞术测量TAM的吞噬能力（pHrodo）、MHC-I/II表达、CD80表达，以及用Seahorse分析糖酵解水平。
检测肥胖和炎症对巨噬细胞PD-1表达的影响
验证肥胖相关的细胞因子、脂肪酸和炎症信号是否直接诱导巨噬细胞PD-1。
用LPS、IFNγ、IL-4、TCM、IL-6、MCP1、IL-1β、TNF、瘦素、胰岛素、棕榈酸等处理BMDMs，检测PD-1表达；使用免疫组化分析人类肿瘤样本中PD-1+巨噬细胞。
研究PD-1对巨噬细胞代谢和功能的直接作用
确定PD-1是否直接调节巨噬细胞糖酵解、吞噬和抗原呈递能力。
通过FACS分选PD-1+和PD-1low/− TAM进行bulk RNA-seq和细胞外通量分析；使用rmPD-L1或抗PD-1处理TCM刺激的BMDMs，检测代谢和功能；使用CRISPR敲除Pten激活mTORC1，观察PD-1表达变化。
评估髓系特异性PD-1缺失对肿瘤免疫的影响
验证巨噬细胞PD-1在肿瘤免疫监视中的直接作用。
使用LysMCre Pdcd1fl/fl小鼠和野生型对照，皮下接种MC38细胞，测量肿瘤生长，分析TAM功能和CD8+ T细胞活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 抗PD-1抗体（RMP1-14） | BioXCell | -- |
| 大鼠IgG2a同型对照（2A3） | BioXCell | -- | |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- |
| 干扰素-γ | -- | -- | |
| 白细胞介素-4 | -- | -- | |
| 棕榈酸 | -- | -- | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | Cayman Chemical | 14325 | |
| 依托莫昔 | Cayman Chemical | 11969 | |
| 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸 | Sigma-Aldrich | D2131 | |
| 信号通路抑制 | 雷帕霉素 | Sigma | -- |
| KJ Pyr 9 | MedChemExpress | -- | |
| 10058-F4 | MedChemExpress | -- | |
| BMS-345541 | Sigma | -- | |
| 信号通路激活 | AICAR | Sigma | -- |
| 代谢分析 | Seahorse XFe96生物分析仪 | Agilent | -- |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | |
| MitoStress检测试剂盒 | Agilent | -- | |
| GlycoStress检测试剂盒 | Agilent | -- | |
| 流式细胞术 | Fc受体阻断剂 | BD | 553142 |
| Ghost Dye Red 780死活染料 | Cell Signaling | 18452S | |
| pHrodo红色大肠杆菌生物颗粒 | Invitrogen | P35361 | |
| BODIPY FL C16荧光染料 | Invitrogen | -- | |
| 2-NBDG葡萄糖类似物 | Sigma | A8625 | |
| 细胞培养 | 重组小鼠PD-L1（rmPD-L1） | R&D Systems | 9048-B7 |
| 组织消化 | 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C2674 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| 细胞分离 | MACS CD45磁珠 | Miltenyi | 130-110-618 |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi | 130-090-101 | |
| CD11b磁珠 | Miltenyi | 130-049-601 | |
| 测序 | Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 饮食诱导肥胖模型 | 饮食配方（D12451或D12450H）、喂养持续时间（20-25周）、小鼠周龄和性别、代谢参数（血糖和胰岛素） 阅读提示：方法部分'Diet treatment'和扩展数据图1 |
| 肿瘤模型建立 | 细胞系（MC38等）、注射细胞数（如5×10^5）、注射途径（皮下或原位）、肿瘤生长天数、肿瘤测量方式 阅读提示：方法部分'Cell lines and primary macrophage isolation'和'Diet treatment' |
| 抗PD-1治疗 | 抗体克隆（RMP1-14）、剂量（200 μg）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（第9、11、13、15天） 阅读提示：方法部分'Diet treatment' |
| 巨噬细胞分离和培养 | 骨髓来源巨噬细胞制备（M-CSF浓度和天数）、BMDM刺激条件（IFNγ、IL-4浓度和时间）、肿瘤条件培养基制备方法 阅读提示：方法部分'Cell lines and primary macrophage isolation' |
| 代谢分析 | 细胞数量、培养基成分、Seahorse分析仪型号、相关试剂浓度（寡霉素、FCCP等） 阅读提示：方法部分'Extracellular flux assay' |
| 流式细胞术 | 抗体克隆和荧光素、染色浓度、死活染料、Fc阻断、gating策略 阅读提示：方法部分'Mouse flow cytometry'和补充图 |