建立DNA甲基化图谱并区分静态与动态CpG
确定哪些CpG位点编码克隆身份，哪些编码分化状态。
对小鼠HSPCs进行scTAM-seq，整合多实验数据，利用表面蛋白表达和转录组注释细胞状态，通过统计分析将CpG分为动态（与分化相关）和静态（与克隆相关）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用体细胞表观突变进行克隆追踪揭示血液老化的动力学
Clonal tracing with somatic epimutations reveals dynamics of blood ageing
实验完整度
高包含小鼠LARRY移植模型、人类骨髓样本、单细胞DNA甲基化组、转录组及线粒体突变分析，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠造血干细胞（HSC）移植模型 人类骨髓CD34+细胞样本 小鼠肺内皮细胞
重点核对
LARRY条形码作为小鼠克隆身份的金标准 CH突变和Y染色体丢失作为人类克隆身份的部分金标准 HhaI酶切条件（150,000 U/ml，37℃30分钟） 静态CpG筛选标准（与表面抗原无显著关联，平均甲基化在25%-90%之间） EPI-Clone参数（PCA 100维，k=5最近邻，密度阈值）
摘要
目前用于通过分化追踪干细胞克隆的方法需要基因工程1,2或依赖稀疏的体细胞DNA变异3,4，这限制了它们的广泛应用。在这里我们发现，一部分CpG位点的DNA甲基化反映细胞分化，而另一部分CpG位点则发生随机的表观突变，可以作为克隆身份的数字条形码。我们证明，在单CpG分辨率下对DNA甲基化进行靶向单细胞分析5可以准确提取这两层信息。为此，我们开发了EPI-Clone，一种无需转基因的大规模谱系追踪方法。应用于小鼠和人类造血系统，我们捕获了数十个个体和230,358个单细胞中的数百条克隆分化轨迹。在小鼠衰老中，我们证明骨髓偏斜和老年造血干细胞6的低输出仅限于少数扩增克隆，而许多功能上类似年轻的克隆在老年时仍然存在。在人类衰老中，带有和不带有已知克隆造血7驱动突变的克隆是年龄相关克隆扩增谱系的一部分，这些扩增显示出相似的谱系偏斜。EPI-Clone能够在规模化的造血细胞状态图谱上实现准确且无需转基因的单细胞谱系追踪。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用内源性的体细胞表观突变作为克隆标记，实现无需转基因的大规模单细胞谱系追踪，并揭示造血衰老过程中克隆动态？
- 核心机制
- 部分静态CpG的DNA甲基化状态作为克隆身份的数字条形码，反映克隆起源；部分动态CpG的甲基化反映细胞分化状态。表观突变在异染色质和晚复制区域富集，可能在快速增殖或甲基化组重塑事件中建立，并稳定遗传。
- 主要证据
- 通过LARRY条形码验证，EPI-Clone能准确识别扩增克隆（AUC=0.79，ARI=0.88）；在小鼠衰老中，HSC扩增克隆主要是髓系偏斜且移植能力低；在人类中，CH克隆和非CH克隆均出现年龄相关扩增，且CH克隆更偏向髓系和干细胞扩增。
- 研究意义
- EPI-Clone提供了一种可扩展、低成本、无需转基因的谱系追踪方法，可用于研究正常和疾病状态下的克隆动态，并提示造血衰老的克隆复杂性下降可能不仅由CH驱动，需更广泛关注克隆性下降。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证EPI-Clone在LARRY金标准中的性能
评估EPI-Clone利用静态CpG识别克隆的准确性。
使用LARRY条形码作为金标准，通过密度分析和聚类，比较EPI-Clone结果与LARRY克隆的一致性。
验证EPI-Clone在不同细胞类型和组织中的适用性
测试EPI-Clone是否能在成熟免疫细胞、髓系细胞和内皮细胞中识别克隆。
对小鼠成熟免疫细胞、髓系细胞和肺内皮细胞进行scTAM-seq，使用M.1定义的静态CpG进行EPI-Clone分析。
研究小鼠衰老过程中的克隆动态
比较年轻和年老小鼠造血克隆的组成和功能差异。
对年轻（12周）和年老（100周）小鼠的骨髓HSPCs进行scTAM-seq和EPI-Clone分析，比较克隆大小、谱系偏斜和HSC输出。
评估HSC扩增克隆的移植能力
确定HSC扩增克隆是否具有正常的再生能力。
将老年小鼠的HSCs进行LARRY标记并移植至致死剂量照射的受体，6个月后分析受体造血，比较移植前后克隆组成。
应用EPI-Clone分析人类骨髓样本
验证EPI-Clone在人类造血系统中识别克隆的能力，并研究年龄相关的克隆扩增。
对人类骨髓CD34+细胞进行scTAM-seq，设计包含CH突变和Y染色体缺失的genotyping amplicons，使用CH突变作为部分金标准验证EPI-Clone。
比较CH克隆与非CH克隆的功能和谱系
探究CH突变和非CH驱动克隆在年龄相关扩增中的异同。
基于EPI-Clone结果，比较CH克隆与非CH克隆的大小、细胞类型组成和谱系偏斜，并分析年龄和GMP比例与克隆累积的关系。
结合转录组和线粒体变异进行多组学验证
验证EPI-Clone克隆的转录组特征和线粒体变异的共分离。
对CD34+样本进行scTAMARA-seq，分析克隆间差异表达基因；对外周血样本进行scTAMito-seq，比较线粒体变异与EPI-Clone克隆的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
评估体内效果
文献明确存在的其他研究目的
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| scTAM-seq单细胞甲基化分析 | HhaI限制性内切酶 | NEB | -- |
| LARRY条形码构建 | Gibson组装预混液 | NEB | E2611L |
| 细菌转化 | NEB 10-beta电转感受态大肠杆菌 | NEB | C3020K |
| 质粒提取 | 无内毒素质粒大提试剂盒 | Macheray Nagel | -- |
| 电穿孔 | Gene Pulser电穿孔仪 | Bio-Rad | -- |
| 小鼠骨髓处理 | 红细胞裂解缓冲液 | BioLegend | 420302 |
| 造血祖细胞富集 | 小鼠谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-110-470 |
| CD117磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | |
| 流式细胞术 | APC抗小鼠CD117抗体 | BioLegend | 105812 |
| PE/Cy7抗小鼠Ly6a抗体 | BioLegend | 108114 | |
| Pacific Blue抗小鼠谱系抗体混合物 | BioLegend | 133310 | |
| PE抗小鼠CD201抗体 | BioLegend | 141504 | |
| PE/Cy5抗小鼠CD150抗体 | BioLegend | 115912 | |
| APC/Cy7抗小鼠CD48抗体 | BioLegend | 103432 | |
| HSC培养 | 纤连蛋白 | R&D Systems | 1030-FN |
| 重组小鼠促血小板生成素 | PeproTech | 315-14 | |
| 重组小鼠干细胞因子 | PeproTech | 250-03 | |
| 流式细胞术 | PerCP/Cyanine5.5抗小鼠/人CD11b抗体 | BioLegend | 101227 |
| PE/Cyanine7抗小鼠CD45.2抗体 | BioLegend | 109829 | |
| Pacific Blue抗小鼠FcεRIα抗体 | BioLegend | 134313 | |
| PE/Cyanine5抗小鼠CD19抗体 | BioLegend | 115509 | |
| Brilliant Violet 605抗小鼠CD11c抗体 | BioLegend | 117333 | |
| APC/Cyanine7抗小鼠Ly-6G抗体 | BioLegend | 127623 | |
| APC抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100235 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠CD115抗体 | BioLegend | 135523 | |
| 内皮细胞富集 | CD31磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 |
| 人类样本处理 | CD34和CD3分选抗体 | BioLegend | 343517 |
| 人类样本染色 | TotalSeq-D血液肿瘤学抗体混合物 | BioLegend | MB53-0053 |
| 小鼠肺组织解离 | 肺组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-927 |
| gentleMACS 'C' 柱子 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| RNA测序 | 10x Genomics Chromium单细胞3'测序 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞DNA甲基化分析（scTAM-seq） | HhaI酶浓度（150,000 U/ml）和消化时间（37°C，30分钟）；上样细胞数（120,000-140,000）；使用的试剂盒化学版本（V2/V3） 阅读提示：Methods: 'Single-cell DNA methylation profiling with scTAM-seq' |
| 小鼠HSC移植 | LARRY转导的HSC数量；受体预处理辐射剂量（5 Gy两次，间隔4小时）；移植后分析时间（5-10个月） 阅读提示：Methods: 'LARRY lentiviral barcoding and transplantation' |
| EPI-Clone分析参数 | 静态CpG定义标准；PCA维数和最近邻数（n=100, k=5）；密度阈值（小鼠扩增克隆阈值0.25%或1%） 阅读提示：Methods: 'Bioinformatic analysis (mouse)' 和 'EPI-Clone' |
| 人类样本处理 | 样本来源和知情同意；CD34+富集方法；基因分型扩增子覆盖的CH突变基因列表 阅读提示：Methods: 'Experimental procedures (human study)' 和 'Human panel design for scTAM-seq' |
| 人类EPI-Clone分析 | 共识静态CpG定义（至少在5个供体中为静态）；排除的细胞类型（T细胞和成熟B细胞）；使用的聚类方法（CHOIR） 阅读提示：Methods: 'EPI-Clone applied to human samples' |