样本选择与长读长测序
获取高质量、长度适中的长读长测序数据，用于SV发现。
从1kGP样本库中选取样本，提取DNA并进行质量控制，使用ONT平台进行长读长测序。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于长读长测序的1,019例多样性人类基因组的结构变异
Structural variation in 1,019 diverse humans based on long-read sequencing
实验完整度
高利用长读长测序、线性与图形参考基因组分析，以及多种方法（如Sniffles、DELLY、SVarp）进行大规模SV发现和基因分型，并通过与HGSVC组装比较和孟德尔一致性检验等进行了质量评估。
主要模型
1,019例人类基因组样本 26个人群 HPRC参考图 患者基因组
重点核对
样本数量：1,019例，覆盖26个人群 测序平台：Oxford Nanopore Technologies（ONT）PromethION 48 测序覆盖度：中位覆盖度16.9×，中位N50读长20.3 kb 参考基因组：GRCh38、CHM13和HPRC_mg图 SV发现方法：Sniffles、DELLY、SVarp
摘要
基因组结构变异（SVs）对遗传多样性和人类疾病有重要贡献，但在群体规模的队列中仍未得到充分表征。在这里，我们对1,019例人类进行了长读长测序，构建了一个覆盖来自千人基因组计划的26个群体的中等覆盖率资源。整合线性和基于图基因组的分析，我们发现了超过100,000个序列解析的双等位SV，并对300,000个多等位可变数目串联重复进行了基因分型，推进了基于短读长的群体规模SV表征。我们表征了不同群体中的缺失、重复、插入和倒位。长散在核元件-1（L1）和SINE-VNTR-Alu（SVA）逆转录转座活性介导了独特序列片段的5′或3′转导，这取决于来源移动元件类别和位点。SV断点分析指向一系列同源介导的过程，这些过程促进了SV的形成和复发性缺失事件。我们的开放获取资源强调了长读长测序在推进SV表征方面的价值，并有助于指导患者基因组中的变异优先级筛选。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用长读长测序在群体规模上全面表征人类基因组的结构变异？
- 核心机制
- L1和SVA逆转录转座介导5′或3′转导，同源介导的修复过程（如NAHR、HDR）促进SV形成和复发。
- 主要证据
- 基于1,019例个体的长读长测序数据，整合线性与图形参考基因组分析，建立了包含超过100,000个双等位SV和300,000个多等位VNTR的目录，并通过多种方法验证了准确性。
- 研究意义
- 该开放获取资源将有助于推进SV生物学和人类疾病研究，并可用于临床基因组中的变异优先级筛选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
序列比对与图形比对
将长读长序列比对到线性和图形参考基因组，为SV发现做准备。
使用minimap2将ONT读段比对到GRCh38和CHM13线性参考，使用minigraph比对到HPRC_mg图参考。
SV发现
利用多种方法从比对中识别结构变异。
使用Sniffles、DELLY和SVarp进行SV发现，并整合不同参考的调用结果。
图形增强
将SV变异整合到图形参考中，以支持群体规模的基因分型。
构建伪单倍型并利用minigraph增强HPRC_mg图，生成HPRC_mg_44+966图。
SV基因分型与定相
在群体中确定SV基因型，并进行单倍型定相。
使用Giggles对增强图进行基因分型，使用SHAPEIT5进行统计定相。
SV变异分类与注释
将SV分为不同类别并分析其特征。
使用SVAN对SV进行分类，包括MEI、VNTR、重复、倒位等，并分析转导事件和断点序列。
SV功能与群体分析
评估SV对基因组功能的影响和群体分化。
使用Ensembl VEP评估SV对基因功能的影响，计算Fst等群体遗传学指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取与质量控制 | Quant-iT双链DNA宽范围检测试剂盒 | Thermo Fisher | Q33130 |
| Varioskan LUX多功能微孔板读数仪 | Thermo Fisher | VL0000D0 | |
| DeNovix DS-11系列分光光度计 | DeNovix | -- | |
| DNA片段长度检测 | Femto Pulse系统 | Agilent | M5330AA |
| 基因组DNA 165 kb梯快速分离试剂盒 | Agilent | FP-1002-0275 | |
| DNA片段筛选 | Circulomics短读长消除试剂盒 | Circulomics | SS-100-101-01 |
| 测序文库构建 | 连接测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK110 |
| NEBNext ONT连接测序配套模块 | New England Biolabs | E7180S | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| NEBNext FFPE DNA修复缓冲液 | New England Biolabs | -- | |
| NEBNext FFPE DNA修复混合液 | New England Biolabs | -- | |
| NEBNext Ultra II末端修复反应缓冲液 | New England Biolabs | -- | |
| NEBNext Ultra II末端修复酶混合液 | New England Biolabs | -- | |
| NEBNext快速T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | -- | |
| 接头混合液 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| 洗脱缓冲液EB | Qiagen | -- | |
| Qubit荧光计 | Thermo Fisher | -- | |
| 测序 | FLO-PRO002（R9.4.1）流动池 | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| PromethION 48测序仪 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| 流动池清洗试剂盒XL | Oxford Nanopore Technologies | EXP_WSH004-XL | |
| 文库构建 | Eppendorf DNA LoBind管 | Eppendorf | -- |
| HulaMixer样品混合器 | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| DNA提取 | TE缓冲液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本选择与DNA提取 | 样本来源（1kGP样本库）、DNA提取方法（从淋巴母细胞系提取）、DNA质量（260/280和260/230比值） 阅读提示：Methods: Samples and DNA extraction |
| 长读长测序 | 测序平台（ONT PromethION 48）、流动池型号（FLO-PRO002 R9.4.1）、文库构建试剂盒（SQK-LSK110）、DNA片段大小选择（≥25 kb） 阅读提示：Methods: LRS |
| 数据比对 | 比对工具（minimap2、minigraph）、参考基因组（GRCh38、CHM13、HPRC_mg）、比对参数（map-ont） 阅读提示：Methods: Reference genome alignments |
| SV发现 | SV调用工具（Sniffles、DELLY、SVarp）、调用参数（如min allele frequency） 阅读提示：Methods: SV discovery using linear references, SV discovery from the graph |
| SV基因分型 | 基因分型工具（Giggles）、参考图（HPRC_mg_44+966）、过滤条件（GQ≥10, F_MISSING≤0.05） 阅读提示：Methods: Graph-aware genotyping |