氧化环化试剂的设计与筛选
设计并筛选能够高效、选择性地对色氨酸进行氧化环化修饰的氧杂吖丙啶试剂。
通过分子轨道计算（DFT）评估18类氧杂吖丙啶的LUMO能量，合成N-磺酰氧杂吖丙啶库，并与Ac-Trp-OMe反应筛选活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
氧化环化试剂揭示色氨酸阳离子-π相互作用
Oxidative cyclization reagents reveal tryptophan cation-π interactions
实验完整度
高包含氧化环化试剂的合成与筛选（体外化学反应）、肽和蛋白水平的生物偶联验证、基于质谱的蛋白质组学分析（ABPP）以及细胞水平的功能验证（突变、抑制剂、荧光成像），涉及多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞裂解液 溶菌酶 GLP-1肽 IL-8蛋白
重点核对
Ox-W18浓度：用于蛋白质标记时，IL-8为300 μM，溶菌酶为1 mM，蛋白质浓度为50 μM；用于蛋白质组标记时，浓度为1 mM（蛋白质组2.5 mg/mL） 反应时间与温度：肽和蛋白质标记反应在室温下进行10分钟；蛋白质组标记在室温下进行30分钟 缓冲液：蛋白质标记使用50 mM Tris（pH 8.0）；蛋白质组标记使用RIPA缓冲液 淬灭：加入过量Ac-Met-OMe溶液淬灭反应 ABPP流程：使用DADPS生物素或脱硫生物素标签进行点击化学，链霉亲和素琼脂糖富集，胰蛋白酶消化，LC-MS/MS分析
摘要
靶向蛋白质上氨基酸的选择性共价修饰方法能够实现多种应用，涵盖蛋白质功能的探针和调节剂以及蛋白质组学。由于半胱氨酸和赖氨酸残基具有高亲核性，它们是通过酸碱反应进行蛋白质生物偶联化学最常见的连接点。在此，我们报道了一种基于氧化还原的色氨酸生物偶联策略，使用模拟吲哚类生物碱生物合成途径中氧化环化反应的氧杂吖丙啶试剂，实现高效且特异的色氨酸标记。我们建立了该方法（称为色氨酸环化化学连接，Trp-CLiC）的广泛应用，用于选择性地将货物连接到肽和蛋白质上的色氨酸残基，其反应速率可与传统的点击化学反应相媲美，并能够实现全蛋白质组中超反应性色氨酸位点的全局分析。值得注意的是，这些试剂揭示了参与阳离子-π相互作用的色氨酸残基的系统性图谱，包括可调节蛋白质介导的相分离过程的功能位点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种基于氧化还原的色氨酸选择性生物偶联方法，并应用该方法系统鉴定蛋白质组中参与阳离子-π相互作用的超反应性色氨酸位点，探究其功能。
- 核心机制
- Trp-CLiC利用N-磺酰氧杂吖丙啶试剂模拟吲哚类生物碱的生物合成氧化环化反应，实现色氨酸吲哚环的环化修饰；该方法鉴定出大量参与阳离子-π相互作用的色氨酸位点，这些相互作用可通过翻译后修饰或突变调控蛋白质相分离。
- 主要证据
- 在肽（GLP-1）、蛋白（溶菌酶、IL-8）和蛋白质组（HEK293T裂解液）水平验证了Trp-CLiC的高效性和选择性；通过ABPP鉴定出906个超反应性色氨酸位点，其中65.1%参与阳离子-π相互作用；功能实验表明NONO Trp271、NPM1 Trp288/Trp290等位点的突变或乙酰化模拟突变改变了相分离行为。
- 研究意义
- 作者提出Trp-CLiC方法为蛋白质组水平鉴定和解析功能性色氨酸位点提供了起点，并为靶向治疗干预提供借鉴。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肽和蛋白质水平的Trp-CLiC验证
评估Trp-CLiC在肽底物（GLP-1）和蛋白质底物（溶菌酶、IL-8）上的标记效率、选择性和稳定性。
使用Ox-W18标记GLP-1、溶菌酶和IL-8，通过LC-MS、紫外-可见光谱、凝胶内荧光检测标记效率；通过突变和LC-MS/MS分析标记位点与溶剂可及性的关系；评估环加合物在不同缓冲液和pH下的稳定性。
蛋白质组水平的ABPP分析
系统鉴定蛋白质组中超反应性色氨酸位点，并分析其生物学特征。
使用Ox-W18标记HEK293T细胞裂解液，进行点击化学连接生物素标签，链霉亲和素富集，胰蛋白酶消化，LC-MS/MS分析鉴定修饰位点；进行生物信息学分析（GO富集、AlphaFold结构筛选、序列基序分析）。
功能位点的验证与机制研究
验证ABPP鉴定出的色氨酸位点在蛋白质相分离中的功能作用，并探究其调控机制。
选择NONO、NPM1等蛋白，通过点突变、抑制剂处理、免疫荧光成像等方法，检测色氨酸或配对赖氨酸突变对相分离和亚细胞定位的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质富集 | Pierce高容量链霉亲和素琼脂糖树脂 | Thermo Fisher Scientific | 20359 |
| GFP-Trap琼脂糖 | Proteintech | gta | |
| 蛋白质消化 | 胰蛋白酶 | Promega | V5280 |
| 肽和蛋白质底物 | GLP-1 | Sigma-Aldrich | SCP0153 |
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | L4919 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| 细胞处理 | 衣霉素 | Sigma-Aldrich | T7765 |
| MG-132 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| 丁苯羟酸 | Thermo Fisher Scientific | B41795G | |
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | |
| 蛋白质标记 | IL-8蛋白 | Sino Biological | 10098-HNCH1 |
| Western blot | 辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素 | Jackson Immuno Research | 016-030-084 |
| 脱盐 | Zeba离心脱盐柱7 kDa MWCO | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 点击化学 | DADPS生物素叠氮化物 | Click Chemistry Tools Company | 1330 |
| 叠氮脱硫生物素 | Click Chemistry Tools Company | 1107 | |
| 蛋白质组学 | Eppendorf Protein LoBind微量离心管 | Eppendorf | 022431081 |
| Western blot | 抗FBL抗体 | Proteintech | 16021-1-AP |
| 抗FUS抗体 | Invitrogen | PA5-52610 | |
| 抗GAPDH (14C10)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| 抗HSP60 (D6F1)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 12165S | |
| 抗TDP43抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| 抗HSPB1抗体 | Proteintech | 18284-1-AP | |
| 抗GFP抗体 | Invitrogen | A6455 | |
| 抗SUMO2/3抗体 | Abcam | ab3742 | |
| 抗α-微管蛋白(DM1A)小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3873S | |
| 抗兔IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| 抗小鼠IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 光谱分析 | Agilent Cary 60紫外-可见分光光度计 | Agilent | -- |
| LC-MS分析 | Proswift RP-4H色谱柱 | Dionex | -- |
| 质谱分析 | Thermo Scientific Q Exactive Plus混合四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 蛋白质纯化 | Xevo G2-XS质谱仪 | Waters | -- |
| Acquity Protein BEH C4色谱柱 | Waters | -- | |
| 荧光成像 | Zeiss 880 LSM激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 分子克隆 | QuikChange | -- | -- |
| 蛋白质表达 | C43 (DE3) Pro+大肠杆菌 | -- | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 氧化环化试剂筛选 | 反应物浓度：Ac-Trp-OMe (50 μM) 与氧杂吖丙啶 (60 μM)；溶剂：PBS/甲醇 (1:1)；反应时间：10分钟；温度：室温；检测方法：LC-MS (254 nm) 阅读提示：Methods中 'Chemical synthesis and screening of the N-sulfonyl oxaziridine library with tryptophan' 章节 |
| 肽标记 | 肽浓度：50 μM；Ox-W18浓度：125 μM；溶剂：5% DMSO/水；反应时间：10分钟；淬灭：500 μM Ac-Met-OMe；检测：Q-TOF 阅读提示：Methods中 'Oxaziridine screening on peptide substrates' 章节 |
| 蛋白质标记 | 蛋白质浓度：50 μM；Ox-W18浓度：IL-8使用300 μM，溶菌酶使用1 mM；缓冲液：50 mM Tris pH 8.0；反应时间：10分钟；变性条件：0.2% SDS，95°C煮沸5分钟；淬灭：过量Ac-Met-OMe；脱盐：Zeba Spin Columns 阅读提示：Methods中 'Protein labelling with N-sulfonyl oxaziridines' 章节 |
| 蛋白质组学标记 | 蛋白质组浓度：2.5 mg/mL（RIPA缓冲液）；Ox-W18浓度：1 mM；孵育时间：30分钟（室温）；淬灭：1 mM Ac-Met-OMe；点击化学：DADPS生物素或脱硫生物素，CuSO4/TBTA；富集：链霉亲和素琼脂糖；消化：胰蛋白酶 阅读提示：Methods中 'Chemoselective tryptophan profiling' 章节 |
| ABPP数据分析 | 报告离子：DADPS生物素 m/z 425.1607 和 213.1715；脱硫生物素 m/z 484.3247；肽段搜索参数：前体质量误差 ±20 ppm，碎片误差 ±20 ppm，FDR 1% 阅读提示：Methods中 'Peptide identification in proteomics experiments' 章节 |
| 细胞实验 | 细胞系：HEK293T或HeLa；培养基：DMEM + 10% FBS + 100 μg/mL 青霉素-链霉素；培养条件：37°C，5% CO2；转染试剂：Lipofectamine 2000；抑制剂浓度和处理时间：bufexamac 50 μM 16小时，nicotinamide 20 mM 16小时，A-485 3 μM 16小时；应激条件：热休克（43°C，2小时）、放线菌素D（8 nM，4小时） 阅读提示：Methods中 'Cell culture', 'Immunofluorescence imaging', 'Cell treatment with inhibitors or diverse stresses' 章节 |