Wnt5b和Ror2在细胞突起上的表达
检测Wnt5b和Ror2是否定位于细胞膜突起（cytonemes）上。
使用Wnt5a/b抗体和Ror2抗体对PAC2细胞进行免疫染色，观察Wnt5b和Ror2在丝状伪足上的定位；过表达Wnt5b-GFP和Ror2-mCherry观察其共定位；并用CRISPR-Cas9敲除Ror2验证转移。
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斑马鱼中活性Wnt5b-Ror2复合物经细胞丝状伪足的运输
Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内斑马鱼胚胎实验、FLIM-FRET/FCCS分子互作分析、功能验证（JNK信号、C&E表型）等多个独立证据层级。
主要模型
PAC2斑马鱼成纤维细胞 斑马鱼胚胎 ror2t13突变斑马鱼 Tg(−6gsc:EGFP–CAAX)斑马鱼
重点核对
Wnt5b-GFP和Ror2-mCherry共定位于cytonemes并在细胞间转移 FLIM-FRET检测显示Wnt5b-Ror2复合物在运输过程中保持结构完整性 FCCS检测测得Wnt5b与Ror2的Kd值约440±80 nM cytoneme形成依赖于JNK信号，SP600125抑制导致cytoneme断裂 IRSp534K或Cdc42T17N抑制cytoneme形成可减少旁分泌JNK信号激活
摘要
化学信号是胚胎中细胞通讯的主要方式。其基本原理是指一组产生配体的细胞和一组因表达相应受体而对该信号作出反应的细胞1,2。在斑马鱼胚胎中，Wnt5b与受体Ror2结合，触发Wnt-平面细胞极性（PCP）信号通路，调节组织极性和细胞迁移3,4。然而，这种亲脂性配体如何从源细胞通过水性细胞外空间运输到靶组织仍不清楚。在本研究中，我们提供了证据表明Wnt5b与Ror2一起负载在称为cytonemes的长突起上。我们的数据进一步表明，活性Wnt5b-Ror2复合物在产生细胞中形成，并从这些cytonemes传递给接收细胞。然后，接收细胞有能力启动Wnt-PCP信号传导，无论其功能性Ror2受体状态如何。在组织水平上，我们进一步表明，cytoneme依赖性的活性Wnt5b-Ror2扩散影响斑马鱼原肠胚的汇聚和延伸。我们认为，cytoneme介导的配体-受体复合物转移是旁分泌信号传导的重要机制。这可能促使人们重新评估仅基于受体表达来表征反应性和非反应性组织的传统概念。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 亲脂性Wnt5b配体如何从产生细胞通过水性细胞外空间运输到靶组织并激活Wnt-PCP信号？
- 核心机制
- Wnt5b与Ror2在产生细胞中形成活性复合物，负载于cytonemes上，经cytoneme运输并内吞进入受体细胞，激活JNK信号，从而调控细胞极性和迁移。
- 主要证据
- 体外PAC2细胞共培养实验显示Wnt5b-Ror2转移；斑马鱼胚胎活体成像观察到cytoneme介导的运输；FLIM-FRET和FCCS证明复合物在运输中保持完整；JNK KTR报告基因显示Wnt5b-Ror2克隆激活旁分泌JNK信号；C&E实验显示cytoneme介导的Wnt5b-Ror2扩散影响汇聚延伸。
- 研究意义
- 提出cytoneme介导的活性配体-受体复合物转移是旁分泌信号的重要机制，可能促使重新评估仅基于受体表达定义反应组织的概念。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Cytoneme介导的Wnt5b-Ror2转运
验证Wnt5b-Ror2复合物在细胞间的转运及其取向。
共培养PAC2细胞和稳定表达secVhh-mCherry的AGS细胞，检测Wnt5b-GFP和Ror2-GFP的细胞外暴露；用dynasore处理抑制dynamin，观察摄取减少；在斑马鱼胚胎中观察cytoneme形成和Wnt5b-GFP/Ror2-mCherry转移，并用Rab5-GFP标记早期内体验证内吞。
Wnt5b-Ror2复合物在运输过程中的稳定性
检测Wnt5b-Ror2复合物在运输过程中是否保持结合。
在斑马鱼胚胎中，使用FLIM-FRET和FCCS测量Wnt5b-GFP和mCherry-Ror2之间的FRET效率和结合亲和力（Kd），在产生细胞、cytonemes和接收细胞中比较，并以Ror2ΔCRD-mCherry和Ror2-mCherry作为阴性对照。
Wnt5b-Ror2信号对cytoneme形成的调控
评估Wnt5b-Ror2信号是否影响cytoneme的形成和稳定性。
在斑马鱼胚胎中过表达Wnt5b、Ror2及突变体，测量丝状伪足的长度和数量；使用IRSp534K和Cdc42T17N抑制cytoneme形成；用JNK抑制剂SP600125处理观察cytoneme断裂。
旁分泌Wnt5b-Ror2信号的功能验证
验证转移的Wnt5b-Ror2复合物是否在受体细胞中激活JNK信号和调控基因表达。
使用KTR-mCherry JNK报告基因检测Wnt5b-Ror2克隆周围的JNK信号；在ror1cr/MZror2t13突变体中检测Wnt5b-Ror2的旁分泌作用；检测对lef1表达的影响；在vangl2突变体或Vangl2显性负性突变体中检测Vangl2依赖性。
Cytoneme介导的Wnt5b-Ror2扩散对汇聚延伸的影响
确定cytoneme介导的Wnt5b-Ror2扩散是否影响斑马鱼胚胎的汇聚和延伸。
在Tg(Gsc-GFPCAAX)胚胎的侧板中胚层表达Wnt5b-Ror2或抑制cytoneme形成，测量脊索宽度和神经外胚层宽度；在ror1cr/ror2cr双突变体中表达Ror2克隆观察表型恢复。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Leibovitz-15培养基 | Gibco | 11415056 |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| 转染 | Fugene HD转染试剂 | Promega | E2312 |
| CRISPR敲除 | Alt-R CRISPR-Cas9反式激活crRNA | IDT DNA | 1072532 |
| EnGen Cas9-NLS酶 | NEB | M0646T | |
| Lonza P2原代细胞4D X试剂盒L | Lonza | V4XP-2024 | |
| DNA测序 | GENEJET基因组DNA纯化试剂盒 | ThermoFisher Scientific | K0721 |
| PCR | PCRBIO Taq预混液（红色） | PCRBIO | PB10.13-02 |
| 免疫染色 | WNT5A-B抗体 | ProteinTech | 55184-1-AP |
| WNT5A-B抗体 | Cell Signaling Technology | 88639S | |
| 山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| ProLong钻石抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA合成 | mMessage mMachine SP6转录试剂盒 | Invitrogen | -- |
| mRNA注射 | 葡聚糖、荧光素和生物素，10000 MW | Invitrogen | -- |
| FCCS校准 | ATTO 488染料 | Sigma Aldrich | -- |
| ATTO 565染料 | Sigma Aldrich | -- | |
| 抑制剂处理 | SP600125 | -- | -- |
| Dynasore | abcam | ab120192 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | PAC2细胞培养条件（28°C，无CO2），AGS细胞培养条件（37°C，5% CO2）；转染试剂Fugene HD用量；共培养时间 阅读提示：Methods：Transfection and CRISPR–Cas9 knockout |
| CRISPR-Cas9敲除 | Ror2 gRNA序列；RNP复合物形成条件；电穿孔参数；筛选和验证方法 阅读提示：Methods：Transfection and CRISPR–Cas9 knockout；Extended Data Fig. 4 |
| 斑马鱼注射 | 注射mRNA浓度（如200 ng/μl）；注射时期（1-cell至16-cell）；用于克隆表达的注射方式 阅读提示：Methods：Microinjection of mRNA；各图图注 |
| FLIM-FRET | 注射mRNA浓度；激发波长488 nm；FRET分析模型（multi-exponential donor）；Förster距离52.4 Å 阅读提示：Methods：FLIM–FRET；Extended Data Fig. 3 |
| FCCS | 校准染料ATTO 488和ATTO 565；有效体积Vef和Vcc；拟合模型（diffusion with triplet和pure diffusion）；Kd计算方法；排除标准（浓度>2000 nM） 阅读提示：Methods：FCCS；Extended Data Fig. 3 |
| JNK报告基因检测 | KTR-mCherry mRNA浓度（250 ng/μl）；注射方案；成像时间（6 hpf）；分析距离（5个细胞行） 阅读提示：Methods：JNK reporter KTR–mCherry assay in vivo；图4图注 |
| in situ杂交 | 探针（lef1、ntl、pax6a）；胚胎固定时间（5 hpf和30 hpf）；双染色步骤 阅读提示：Methods：Zebrafish in situ hybridization；Extended Data Fig. 7 |
| 汇聚和延伸实验 | Tg(−6gsc:EGFP–CAAX)胚胎；注射方案；测量时间点（10 hpf和32 hpf）；脊索宽度和细胞圆度测量方法 阅读提示：Methods：Cell extension and convergence assay；图5图注 |