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        在神经退行性疾病中突变的E3连接酶对应激反应的沉默

        Stress response silencing by an E3 ligase mutated in neurodegeneration

        作者信息Diane L Haakonsen, Michael Heider, Andrew J Ingersoll, Kayla Vodehnal, Samuel R Witus, Takeshi Uenaka, Marius Wernig, Michael Rapé
        PMID38297121
        期刊Nature
        发布时间2024-02
        DOI10.1038/s41586-023-06985-7
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外泛素化实验、细胞系基因编辑、CRISPR合成致死筛选、RNA-seq转录组分析等多层次验证，并进行功能与机制验证。

        主要模型

        HEK293T细胞系 U2OS细胞系 人类H1胚胎干细胞 诱导多能干细胞来源的神经元

        重点核对

        SIFI复合物包括UBR4、KCMF1和钙调蛋白 SIFI靶向底物cDELE1和HRI SIFI通过识别双功能基序（converging degrons）实现降解 SIFI沉默整合应激反应的机制 ISRIB可恢复SIFI突变细胞的存活

        摘要

        应激反应通路检测并缓解不利条件以保护细胞和组织稳态，然而它们的持续激活会诱导细胞凋亡并破坏机体健康。应激反应如何在正确的时间和地点被关闭仍知之甚少。在这里，我们报道了一种泛素依赖性机制，该机制沉默细胞对线粒体蛋白输入应激的反应。这一过程的关键是整合应激反应的沉默因子（SIFI），它是一个大的E3连接酶复合物，在共济失调和早发性痴呆中发生突变，它同时降解未输入的线粒体前体和应激反应组分。通过识别双功能底物基序，这些基序同时编码蛋白质定位和稳定性，SIFI复合物在特定应激事件得到解决后关闭一般性应激反应。药理学上的应激反应沉默即使在应激解决失败的情况下也能维持细胞存活，这强调了信号终止的重要性，并为治疗由线粒体输入缺陷引起的神经退行性疾病提供了路线图。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        应激反应如何在正确的时间和地点被关闭，以及这一过程与神经退行性疾病的关系？
        核心机制
        SIFI通过识别底物上的双功能基序（converging degrons），同时降解未输入的线粒体前体与应激反应组分cDELE1和HRI，从而在特定应激事件解决后关闭整合应激反应。
        主要证据
        通过CRISPR合成致死筛选确定SIFI组分；通过稳定性报告子和体外泛素化实验证明SIFI靶向cDELE1和HRI；通过RNA-seq和Western blot证明SIFI限制ISR信号持续时间。
        研究意义
        该研究揭示了应激反应沉默的主动调控机制，并为治疗由线粒体输入缺陷引起的神经退行性疾病提供了潜在策略，如使用ISRIB进行药理干预。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        筛选SIFI复合物的合成致死相互作用

        鉴定与UBR4缺失合成致死的基因，以揭示UBR4的功能通路。

        在HEK293T细胞中进行全基因组CRISPR-Cas9合成致死筛选，比较WT和ΔUBR4细胞的sgRNA耗竭情况。

        2

        验证SIFI复合物的组成和功能

        确认UBR4与KCMF1、钙调蛋白的相互作用，并验证其对线粒体应激的敏感性。

        通过内源性亲和纯化和质谱鉴定UBR4和KCMF1的结合伴侣；通过竞争实验检测不同SIFI组分缺失对线粒体应激的敏感性。

        3

        鉴定SIFI底物

        识别SIFI复合物的泛素化底物。

        利用稳定性报告子筛选UBR4底物，筛选出cDELE1和HRI；通过Western blot和流式细胞术验证其稳定性。

        4

        分析SIFI对底物的翻译后修饰

        验证SIFI对底物进行泛素化并促进蛋白酶体降解。

        在体外和细胞内进行泛素化实验，使用特异性抗体和质谱分析泛素链连接类型。

        5

        研究SIFI对整合应激反应的影响

        阐明SIFI在调节整合应激反应中的作用。

        利用ISR报告子、Western blot和RNA-seq分析野生型和ΔUBR4细胞在应激条件下的ATF4水平变化。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹免疫荧光共聚焦显微镜
        验证分子表达变化
        逆转录定量PCRRNA测序
        验证蛋白功能变化
        流式细胞术细胞竞争实验
        验证泛素化机制
        体外泛素化实验蛋白质稳定性报告子实验
        数据分析与统计
        CRISPR-Cas9合成致死筛选基因本体分析层次聚类

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM+谷氨酰胺培养基Gibco10566-016
        胎牛血清VWR89510-186
        转染聚乙烯亚胺Polysciences23966-1
        Lipofectamine 3000转染试剂Thermo FisherL3000008
        siRNA转染RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher13778150
        慢病毒生产Lenti-X浓缩器Takara631232
        慢病毒感染聚凝胺Sigma-AldrichTR-1003
        药物筛选嘌呤霉素Sigma-AldrichP8833
        杀稻瘟菌素Thermo FisherA1113903
        潮霉素Gibco10687010
        干细胞培养StemFlex培养基Thermo FisherA3349401
        基质胶Corning354234
        干细胞分化Accutase细胞分离液Innovative Cell TechnologiesAT104
        ROCK抑制剂Y-27632Axon Medchem1683
        神经元培养mTeSR plus培养基StemCell Technologies100-0276
        神经元分化N-2添加剂Gibco17502048
        Chroman IMedChem ExpressHY-15392
        多聚-L-鸟氨酸Sigma AldrichP3655
        BrainPhys培养基StemCell Technologies05790
        B-27 plus添加剂GibcoA3582801
        胶质细胞源性神经营养因子PeproTech450-10
        脑源性神经营养因子PeproTech450-02
        神经营养因子-3PeproTech450-03
        小鼠层粘连蛋白Gibco23017015
        分子克隆HIFI DNA组装预混液NEBE2621L
        CRISPR基因编辑Mirus TransIT-293转染试剂MirusMIR2705
        质粒提取Zymo Research Quick-gDNA MidiPrep试剂盒Zymo ResearchD3100
        PCRQ5高保真DNA聚合酶NEBM0491
        测序HiSeq4000测序仪Illumina--
        裂解苯甲酸酶Sigma-AldrichE1014
        cOmplete蛋白酶抑制剂混合物Roche11836170001
        免疫沉淀抗Flag M2亲和树脂Sigma-AldrichA2220
        3xFlag肽SigmaF4799
        质谱胰蛋白酶Promegav5111
        LTQ XL线性离子阱质谱仪Thermo Scientific--
        药物处理寡霉素ASanta Cruz Biotechnologysc-201551
        鱼藤酮Sigma-AldrichR8875-1G
        BTdCPUEMD Millipore324892
        毒胡萝卜素Sigma-AldrichT9033-.5MG
        衣霉素Calbiochem65438010
        EN6Sigma-AldrichSML2689-5MG
        巴佛洛霉素A1Selleck ChemicalsS1413
        17-DMAGSelleck ChemicalsS1142
        卡非佐米Selleck ChemicalsS2853
        ISRIBSigma-AldrichSML0843
        Western blotPhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物Roche4906837001
        Pierce 660nm蛋白质检测试剂Thermo Fisher22660
        免疫沉淀Ni-NTA琼脂糖珠Qiagen20350
        免疫荧光Hoechst 33342染色液Anaspec83218
        ProLong gold封片剂Thermo FisherP36930
        共聚焦显微镜Zeiss LSM 900共聚焦显微镜（配备Airyscan 2）Zeiss--
        RNA-seqnucleospin RNA提取试剂盒Macherey-Nagel740955
        qPCRRevertAid第一链cDNA合成试剂盒Thermo Fisher ScientificK1622
        KAPA SYBR Fast qPCR预混液RocheKK4602
        体外泛素化泛素R&D SystemsU-100H
        E1酶UBA1实验室纯化--
        抗体抗Flag抗体（小鼠单克隆，M2）Sigma-AldrichF1804
        抗Flag抗体（兔多克隆）Cell Signaling Technology2368
        抗HA标签抗体Cell Signaling Technology3724
        抗GAPDH抗体Cell Signaling Technology5174
        抗α-微管蛋白抗体CalbiochemCP06
        抗UBR4/p600抗体（A302-277A）BethylA302-277A
        抗UBR4/p600抗体（A302-278A）BethylA302-278A
        抗UBR4/p600抗体（A302-279A）BethylA302-279A
        抗PKR抗体Santa Cruzsc-6282
        抗GCN2抗体Santa Cruzsc-374609
        抗PERK抗体Santa Cruzsc-377400
        抗UBE2A/B抗体Santa Cruzsc-365507
        抗ATF4抗体Cell Signaling Technology11815S
        抗EIF2AK1抗体Proteintech20499-1-AP
        抗SSBP1抗体Proteintech12212-1-AP
        抗TIM8A抗体Proteintech11179-1-AP
        抗KCMF1抗体SigmaHPA030383
        抗NIPSNAP3A抗体Thermo FisherPA5-20657
        抗GADD34抗体Proteintech10449-1-AP
        抗CReP抗体Proteintech14634-1-AP
        抗泛素抗体Cell Signaling Technology43124
        山羊抗兔IgG (H+L) HRPVector LaboratoriesPI-1000
        绵羊抗小鼠IgG (H+L) HRPSigmaA5906
        山羊抗小鼠IgG轻链特异性HRP偶联抗体Jackson Immunoresearch115-035-174
        免疫荧光抗TOM20抗体Proteintech11802-1-AP
        山羊抗兔AF647二抗Thermo FisherA21245

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞培养
        HEK293T和U2OS细胞系来源；培养基组成（DMEM+Glutamax, 10% FBS）；培养条件（37°C, 5% CO2）
        阅读提示：Methods: Mammalian cell culture
        CRISPR-Cas9基因编辑
        sgRNA序列；供体寡核苷酸（ssODN）；转染试剂；筛选方法（PCR、测序、Western blot）
        阅读提示：Methods: Generation of CRISPR–cas9 genome edited cell lines
        合成致死筛选
        文库（GeCKO v2）；MOI；筛选时间；细胞密度；测序数据质量控制
        阅读提示：Methods: Synthetic lethal whole-genome CRISPR–Cas9 screen
        蛋白质稳定性报告子测定
        报告子质粒；细胞密度；转染方法；检测时间；流式细胞仪设置
        阅读提示：Methods: Protein stability reporter assay
        体外泛素化
        SIFI复合物纯化方法；E1、E2酶、泛素浓度；反应时间；检测方法（放射性自显影或荧光成像）
        阅读提示：Methods: In vitro ubiquitylation assays
        细胞竞争实验
        GFP和mCherry标记细胞比例；筛选时间；药物浓度；检测方法
        阅读提示：Methods: Growth competition assays

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