冷冻电镜结构解析
确定丙泊酚与HCN1的结合位点
将人HCN1 WT和M305L突变体重构至脂质纳米盘，在有无丙泊酚条件下进行单颗粒冷冻电镜结构解析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
丙泊酚恢复HCN1通道癫痫突变体的电压依赖性门控
Propofol rescues voltage-dependent gating of HCN1 channel epilepsy mutants
实验完整度
高包含冷冻电镜结构解析、电生理功能验证（TEVC和电压钳荧光）、突变体分析及分子动力学模拟等多种独立证据。
主要模型
人HCN1通道（脂质纳米盘重组） 海胆spHCN通道（爪蟾卵母细胞表达） 爪蟾卵母细胞表达系统 HEK293S GnTI−细胞
重点核对
丙泊酚结合位点1的残基（Met305、Thr384、Phe389等） HCN1癫痫突变体M305L和D401H的电压依赖性恢复 spHCN同源突变M375L和F459的电压传感器运动 丙泊酚浓度（30 μM用于电生理，1 mM用于冷冻电镜） 电压钳协议（从+45 mV至-125 mV，尾电流在+50 mV）
摘要
超极化激活环核苷酸门控（HCN）通道对于起搏活动和神经信号传导至关重要。抑制HCN1的药物是治疗神经病理性疼痛和癫痫发作的有前景的候选药物。全身麻醉药丙泊酚（2,6-二异丙基苯酚）是已知的HCN1变构抑制剂，但其结构基础未知。在此，我们使用单颗粒冷冻电镜和电生理学表明，丙泊酚通过结合S5和S6跨膜螺旋之间的沟槽中的一个机制性热点来抑制HCN1。我们发现丙泊酚恢复了两个HCN1癫痫相关多态性（通过 destabilizing 通道关闭态起作用）的电压依赖性关闭：位于S5丙泊酚结合位点的M305L，以及S6中的D401H。为了理解丙泊酚抑制和恢复电压门控的机制，我们追踪了spHCN通道中电压传感器的运动，发现丙泊酚抑制与电压传感器构象变化无关。在spHCN中与该甲硫氨酸同源的突变以及S6中相邻的保守苯丙氨酸同样 destabilize 关闭，而不破坏电压传感器运动，表明电压依赖性关闭需要该界面完整。我们提出了一个电压依赖性门控模型，其中丙泊酚稳定了HCN通道中该保守甲硫氨酸-苯丙氨酸界面处电压传感器与孔之间的偶联。这些发现为利用该位点设计针对HCN通道病的新型特异性药物提供了可能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 丙泊酚如何抑制HCN1通道以及其结构基础是什么？
- 核心机制
- 丙泊酚结合在HCN1通道S5和S6螺旋之间的疏水口袋（位点1），稳定关闭态，增强电压传感器与孔之间的偶联，从而抑制通道开放并恢复突变体的电压依赖性关闭。该偶联依赖于S5上的Met305与S6上的Phe389之间的甲硫氨酸-芳香族相互作用。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示丙泊酚结合于S5-S6沟槽，电生理实验表明丙泊酚使WT通道V1/2超极化移位约30 mV，并使M305L和D401H突变体恢复电压依赖性门控。spHCN通道的电压钳荧光实验显示丙泊酚不改变电压传感器运动，且Met375和Phe459突变导致通道组成性开放。
- 研究意义
- 该研究揭示了一个变构调控的机制性热点，为设计针对HCN通道病（如癫痫）的新型特异性药物提供了结构基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
电生理功能验证
验证丙泊酚对HCN1 WT及突变体电流的抑制作用
在爪蟾卵母细胞中表达HCN1 WT及突变体，使用双电极电压钳记录电流，测量有无30 μM丙泊酚时的电压依赖性激活。
电压钳荧光检测电压传感器运动
检测丙泊酚及突变对电压传感器运动的影响
在爪蟾卵母细胞中表达spHCN WT及突变体（R332C标记Alexa488），使用电压钳荧光技术同时记录电流和荧光信号，测量GV和FV关系。
分子动力学模拟
评估丙泊酚在结合位点的稳定性
对丙泊酚结合的HCN1结构进行全原子分子动力学模拟，观察丙泊酚在结合位点的驻留时间。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 电生理记录 | OC-725C钳制放大器 | Warner | -- |
| ITC-18转换器 | Instrutech Corp | -- | |
| Axon Geneclamp 500B放大器 | Axon Instruments, Inc. | -- | |
| Axon Digidata 1322A | Axon Instruments, Inc. | -- | |
| 冷冻电镜 | Talos Arctica显微镜 | FEI, ThermoFisher | -- |
| Titan Krios显微镜 | FEI, ThermoFisher | -- | |
| GatanK3相机 | -- | -- | |
| 冷冻电镜样品制备 | Vitrobot Mark IV | FEI, ThermoFisher | -- |
| 软件分析 | Relion | -- | -- |
| Phenix | -- | -- | |
| Coot | -- | -- | |
| ChimeraX | -- | -- | |
| ImageJ | -- | -- | |
| 分子动力学模拟 | Gromacs | -- | -- |
| CHARMM-GUI | -- | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | 月桂基麦芽糖新戊二醇 | -- | -- |
| 胆固醇半琥珀酸酯 | -- | -- | |
| GDN | -- | -- | |
| Superose 6 Increase 色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| 细胞染色 | NucBlue活细胞染色剂 | Invitrogen | R37605 |
| CellMask Deep Red质膜染色剂 | Invitrogen | C10045 | |
| 电生理记录 | 丙泊酚 | Sigma | -- |
| ZD7288 | Tocris Bioscience | -- | |
| 电压钳荧光 | Alexa-488 C5-马来酰亚胺 | Molecular Probes | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 双电极电压钳 | 丙泊酚浓度（30 μM）、电压协议（从+45 mV至-135 mV，尾电流在+50 mV）、记录溶液成分（107 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4） 阅读提示：Methods: Two Electrode Voltage Clamp |
| 电压钳荧光 | spHCN突变体（R332C）、荧光标记浓度（100 μM）、电压协议（从+40 mV至-160 mV，步阶-20 mV）、丙泊酚浓度（10 μM） 阅读提示：Methods: Voltage clamp fluorometry (VCF) |
| 冷冻电镜 | 纳米盘脂质组成（DOPC:POPE:POPS=5:3:2）、丙泊酚浓度（1 mM）、MSP类型（MSP1E3或MSP2N2） 阅读提示：Methods: Protein expression, purification, and nanodisc reconstitution |
| 分子动力学模拟 | 力场（CHARMM36）、脂质组成（DOPC:POPE:POPS或POPC）、模拟时间（400 ns）、温度（300 K） 阅读提示：Methods: Molecular dynamics simulation |