构建表达系统与核糖体结合分析
确定ZAK与核糖体的结合模式及激活状态
在HEK293T细胞中过表达N端标签的野生型或激酶失活ZAK突变体，通过蔗糖梯度分级和Phos-tag免疫印迹分析核糖体结合和磷酸化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ZAK在碰撞核糖体上的激活
ZAK activation at the collided ribosome
实验完整度
高研究采用冷冻电镜（单颗粒分析）确定ZAK-碰撞核糖体复合物结构，结合生化与细胞实验（突变分析、敲除、蔗糖梯度、CLIP-seq）验证多个功能位点，并体外重建复合物，多层次证据支持激活机制。
主要模型
HEK293T细胞 Expi293F细胞 ZAK敲除的HEK293T细胞 RACK1敲除的HEK293T细胞 人80S核糖体及40S亚基
重点核对
ZAK的RIH基序（Y611、V615、R616）对核糖体结合和激活的必要性 RIM基序（F417、L420、K422）对碰撞敏感性及激活的必要性 SAM结构域二聚化界面残基（K394、K387、D388、D385）对激酶活性的调控 SERBP1的FPxL基序与ZAK的RIM竞争结合RACK1，负调控ZAK激活 eS27-pin（W768）及ES7-patch突变导致核糖体结合丧失并抑制激活
摘要
核糖体碰撞通过MAP3K ZAK激活核毒性应激反应，该反应通过下游磷酸化MAPK p38和JNK1调控细胞命运结果。尽管ZAK在细胞应激中发挥关键作用，但对ZAK-核糖体相互作用及其如何导致激活的机制和结构理解仍然难以捉摸。在这里，我们结合生物化学和冷冻电子显微镜，发现了ZAK与核糖体之间不同的相互作用，这些相互作用对于组成型招募和激活是必需的。我们发现，在核糖体碰撞诱导后，ZAK与核糖体蛋白RACK1的相互作用通过其SAM结构域在碰撞界面二聚化而使其激活。此外，我们发现了这一过程如何被核糖体结合蛋白SERBP1负调控，以防止组成型ZAK激活。对新型SAM变体以及已知的ZAK SAM结构域致病性变体的表征支持SAM结构域在调节核糖体上和核糖体外的激酶活性中起关键作用，其中一些突变体绕过核糖体对ZAK激活的要求。总的来说，我们的数据提供了ZAK在碰撞核糖体界面激酶活性的机制蓝图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZAK如何被招募到核糖体并在碰撞时激活，其结构基础是什么？
- 核心机制
- 核糖体碰撞导致ZAK的RIM基序结合RACK1，SAM结构域在碰撞界面形成头对尾二聚体，促进激酶激活；SERBP1通过竞争RACK1上的FPxL位点负调控此过程。
- 主要证据
- 通过冷冻电镜解析ZAK-碰撞二聚体复合物结构，结合突变分析、CLIP-seq和细胞实验验证了pin、RIH、RIM和SAM二聚化在核糖体结合和激活中的作用。
- 研究意义
- 该研究提供了ZAK在碰撞核糖体上激活的机制蓝图，为理解核毒性应激反应和细胞命运调控提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
解析ZAK结合碰撞二聚体（disome）的结构，鉴定相互作用界面
从Expi293F细胞纯化FLAG标签ZAK突变体核糖体复合物（有无ANS处理），进行单颗粒冷冻电镜分析和三维重建，构建原子模型。
突变分析鉴定结合基序
验证pin、RIH、RIM等基序对核糖体结合和激活的功能
在ZAK敲除细胞中表达野生型或特定残基突变的ZAK，通过蔗糖梯度分析核糖体结合，检测ZAK和JNK磷酸化以评估激活。
RACK1敲除验证
确认RACK1对ZAK结合和激活的必要性
在RACK1敲除HEK293T细胞中检测内源性ZAK的核糖体分布和ANS诱导的磷酸化。
SERBP1负调控分析
验证SERBP1是否通过竞争RACK1结合负调控ZAK激活
使用siRNA敲低SERBP1，检测基础状态和ANS激活条件下JNK磷酸化水平。
CLIP-seq分析
鉴定ZAK与18S rRNA的接触位点，验证ES7和ES6b/c的相互作用
在ZAK敲除细胞中过表达FLAG标签ZAK（WT或T161/S165A），进行CLIP-seq，分析ZAK结合rRNA的富集区域。
SAM二聚化突变分析
研究SAM结构域二聚化对激酶活性的调控
表达SAM界面残基突变体（如K387D、K394D）和致病突变F368C，检测基础状态和ANS处理下的磷酸化及蛋白稳定性。
体外结合实验
验证ZAK RBR与40S亚基特异性结合
纯化GST标记ZAK RBR，与纯化的40S、60S或80S核糖体孵育，通过pull-down检测结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo | 11995073 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | A3160502 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | L3000075 |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo | 13778150 | |
| 药物处理 | 茴香霉素 | Sigma | A9789 |
| 二甲基亚砜 | Thermo | D12345 | |
| 蛋白质稳定性 | MLN4924 | ApexBio | B1036 |
| 尼洛替尼 | ApexBio | A8232 | |
| 免疫印迹 | 抗FLAG M2抗体 | Sigma | A8592 |
| 抗JNK1抗体 | Cell Signaling | 3708 | |
| 抗磷酸化SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling | 4668S | |
| 抗RACK1抗体 | Cell Signaling | 5432S | |
| 抗SERBP1抗体 | Novus | NBP1-85660 | |
| 抗eS24抗体 | Abcam | ab196652 | |
| 抗ZAK抗体 | Fortis | A301-993A | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Millipore | M8823 |
| 抗FLAG M2亲和树脂 | Millipore | A2220 | |
| 核糖体纯化 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽Sepharose 4快速流动树脂 | Cytiva | -- |
| 冷冻电镜 | Titan Krios显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Falcon 4i直接电子探测器 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HEK293T细胞培养基（DMEM+10% FBS），转染试剂（Lipofectamine 3000），药物处理浓度和时间（ANS 0.38 μM，15分钟），实验重复次数（至少两次独立生物学重复） 阅读提示：Methods 中 'Tissue culture' 和 'Statistics and reproducibility' 部分 |
| 核糖体结合分析 | 蔗糖梯度条件（10-50%），离心参数（274,000g，1小时45分钟），上样量（约25-50 μg RNA），检测方法（Phos-tag免疫印迹） 阅读提示：Methods 中 'Sucrose gradients' 和 'Immunoblotting' 部分 |
| 冷冻电镜样品制备 | Expi293F细胞表达体系，ANS处理浓度和时间（0.38 μM，15分钟），FLAG pull-down条件（珠材料、洗涤、洗脱液），冷冻制样条件（Quantifoil R3/3 grids，2 nm碳膜） 阅读提示：Methods 中 'Native pull-downs of ZAK-bound ribosomal complexes for cryo-EM' 和 'Electron microscopy and image processing' 部分 |
| 突变分析 | ZAK敲除HEK293T细胞，表达载体（部分CMV启动子），突变位点（pin W768A、ES7-patch、RIH、RIM、SAM界面等），检测ZAK和JNK磷酸化 阅读提示：Methods 中 'Generation of the knockout cell line' 和 'Tissue culture' 部分，以及Figure Legends (Fig. 2e,f等) |
| SERBP1敲低实验 | siRNA浓度（50 nM），转染时间（72小时），ANS处理条件，JNK磷酸化检测 阅读提示：Methods 中 'RNA knockdowns' 部分和Figure Legend (Fig. 4i) |