全基因组CRISPR筛选鉴定宿主因子
鉴定对BFT毒性必需的宿主基因，特别是参与E-钙黏蛋白切割的宿主因子。
在HT29-Cas9细胞中利用Avana CRISPR文库进行两轮BFT选择，通过表面E-钙黏蛋白染色分离抗性细胞，并通过MAGeCK分析基因富集。
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一种促癌细菌毒素结合claudin-4以切割E-钙黏蛋白
A pro-carcinogenic bacterial toxin binds claudin-4 to cleave E-cadherin
实验完整度
高通过全基因组CRISPR筛选、体外细胞模型（HT29、T84、293T）验证、蛋白结合实验、结构建模及小鼠盲肠注射模型等多层级实验，对BFT受体识别及E-钙黏蛋白切割机制进行了功能验证和体内验证。
主要模型
HT29细胞系 T84细胞单层 293T细胞异源表达系统 小鼠盲肠注射模型
重点核对
BFT处理浓度与时间 claudin-4敲除细胞系 E-钙黏蛋白切割检测 CLN4sol阻断效果
摘要
人类结肠被数以万亿计的细菌定植，这些细菌在人类健康和疾病中发挥着重要作用1。流行病学和实验研究表明，某些结肠细菌可以刺激结直肠癌的发生和发展2。其中一种细菌，产肠毒素性脆弱拟杆菌，通过单一毒素——脆弱拟杆菌毒素（BFT）的作用驱动结肠肿瘤形成3,4。BFT是一种金属蛋白酶，与结肠上皮细胞受体结合，导致E-钙黏蛋白胞外域切割，进而引起上皮屏障破坏、炎症和细胞增殖增加4–6。然而，BFT受体的身份尚不清楚，BFT引发的E-钙黏蛋白切割的分子机制也未完全阐明。在此，我们通过全基因组CRISPR筛选确定claudin-4为BFT受体，并证明claudin-4结合促进BFT介导的细胞表面E-钙黏蛋白切割。我们的工作既阐明了BFT的作用机制，也为开发抗BFT疗法开辟了途径，这可能对结直肠癌预防和急性产肠毒素性脆弱拟杆菌感染的治疗有用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BFT如何通过其未知受体介导E-钙黏蛋白切割，从而促进结直肠癌发生？
- 核心机制
- claudin-4作为BFT受体，其结合促进BFT对细胞表面E-钙黏蛋白胞外域的切割，导致上皮屏障破坏、炎症和细胞增殖增加。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定claudin-4为BFT受体，敲除claudin-4的HT29细胞对BFT产生抗性，体外结合及切割实验证实claudin-4结合促进E-钙黏蛋白切割，小鼠盲肠注射模型验证CLN4sol阻断BFT毒性。
- 研究意义
- 此研究揭示了BFT作用的新机制，并提出了通过阻断claudin-4结合来开发抗BFT疗法的策略，可能对结直肠癌预防和治疗急性产肠毒素性脆弱拟杆菌感染具有潜在价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证claudin-4在BFT毒性中的作用
验证claudin-4是否为BFT毒性的关键介质。
构建claudin-4敲除HT29和T84细胞系，检测BFT诱导的细胞变圆、E-钙黏蛋白切割和跨上皮电阻变化，并比较claudin-3敲除的效果。
证明claudin-4是BFT的直接受体
确定claudin-4是否直接与BFT结合。
通过流式细胞术、免疫印迹、免疫共沉淀以及pull-down实验检测BFT与细胞表面或可溶性claudin-4的结合，并使用SEC-MALS分析复合物形成。
阐明claudin-4促进E-钙黏蛋白切割的机制
确定claudin-4结合如何促进BFT对E-钙黏蛋白的切割。
在293T细胞中共表达E-钙黏蛋白和claudin-4突变体，检测BFT介导的切割情况，通过突变分析关键残基，并使用AlphaFold模型预测复合物结构。
体内验证可溶性claudin-4阻断BFT毒性
验证可溶性claudin-4能否在体内阻断BFT的毒性作用。
在小鼠盲肠内注射BFT和CLN4sol或对照蛋白，通过组织学和免疫荧光评估上皮损伤和E-钙黏蛋白完整性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | -- | -- |
| DMEM/F-12培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 抗体检测 | β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5441 |
| Claudin-4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376643 | |
| Alexa Fluor 647标记的claudin-4抗体 | R&D | FAB4219R | |
| His标签抗体 | R&D Systems | MAB050 | |
| GFP抗体 | Invitrogen | MA1-952 | |
| Claudin-3抗体 | Cell Signaling Technology | 83609S | |
| Na/K ATP酶α1抗体 | Cell Signaling Technology | D4Y7E | |
| E-钙黏蛋白胞外域抗体 | Invitrogen | 14-3249-82 | |
| PE标记的E-钙黏蛋白胞外域抗体 | BioLegend | 147304 | |
| 免疫沉淀 | Claudin-4抗体 | Invitrogen | 36-4800 |
| Claudin-2抗体 | Invitrogen | 51-6100 | |
| 抗体检测 | 抗BFT兔多克隆抗血清 | -- | -- |
| Alexa Fluor 488标记的抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11001 | |
| HRP标记的抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记的抗大鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7077 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Kindle Biosciences | R1005 | |
| 分子克隆 | In-Fusion克隆试剂盒 | Takara Bio | -- |
| QuikChange II定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 蛋白纯化 | HisTrap柱 | Cytiva Life Sciences | -- |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T6567 | |
| HisPur Ni-NTA树脂 | Thermo Fisher | -- | |
| PD-10脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| Mono Q 5/50 GL色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 筛选 | Cellstripper细胞剥离液 | Corning | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 胶原酶D | -- | -- | |
| SH800S细胞分选仪 | Sony | -- | |
| 血液和细胞培养DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Illumina MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 稳定细胞系构建 | lentiGuide-Puro质粒 | Addgene | 52963 |
| lentiCRISPR v2质粒 | Addgene | 52961 | |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| pCMV-VSV-G质粒 | Addgene | 8454 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| lentiGuide-Hygro质粒 | Addgene | 139462 | |
| 潮霉素B | -- | -- | |
| pLenti-CMV-GFP-Hygro质粒 | Addgene | 17446 | |
| 细胞成像 | 尼康ECLIPSE Ts2显微镜 | Nikon | -- |
| 流式分析 | TrypLE表达酶 | Thermo Fisher | -- |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher | -- | |
| Aurora流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| 蛋白分析 | Amicon超滤管 | Amicon | -- |
| 细胞培养 | 多聚-D-赖氨酸 | Sigma | -- |
| 转染 | OptiPro-SFM无血清培养基 | Thermo Fisher | -- |
| TransIT-LTI转染试剂 | Mirus Biosciences | -- | |
| 免疫沉淀 | 对照琼脂糖树脂 | Pierce | -- |
| Protein A/G Plus琼脂糖 | Pierce | -- | |
| 双琥珀酰亚胺基辛二酸酯 | -- | -- | |
| 蛋白检测 | BCA蛋白测定试剂盒 | Pierce | -- |
| Western blot | cOmplete Mini蛋白酶抑制剂片 | Roche | -- |
| NuPAGE LDS样品缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris预制胶 | Invitrogen | -- | |
| NuPAGE MES SDS电泳缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| NuPAGE转印缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher | -- | |
| iBright CL1500成像系统 | Invitrogen | -- | |
| Restore剥离缓冲液 | Thermo Fisher | -- | |
| 蛋白相互作用 | Penta-His一抗 | Qiagen | -- |
| IRDye 800CW标记的山羊抗小鼠二抗 | LI-COR | -- | |
| Odyssey Fc成像仪 | LI-COR | -- | |
| TER测量 | Transwell插入式培养皿 | Corning | 3470 |
| EVOM2上皮电阻仪 | World Precision Instruments | -- | |
| STX2电极 | World Precision Instruments | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 组织处理 | 福尔马林 | -- | -- |
| Gill 3苏木素 | -- | -- | |
| 伊红 | -- | -- | |
| DPX封片剂 | Sigma | -- | |
| 免疫荧光 | 抗E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195T |
| DyLight488标记的驴抗兔IgG | BioLegend | 406404 | |
| DAPI Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | -- | |
| LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| SEC | Superdex 200 Increase 10/300凝胶柱 | Cytiva | -- |
| AKTA纯化系统 | Cytiva | -- | |
| SEC-MALS | Prominence高效液相色谱系统 | Shimadzu | -- |
| DAWN HELEOS II多角度光散射检测器 | Wyatt Technology | -- | |
| Optilab T-REX示差折光检测器 | Wyatt Technology | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Wyatt Technology | -- | |
| 表面生物素化 | 磺基-NHS-生物素 | Thermo Fisher | -- |
| NeutrAvidin琼脂糖珠 | Pierce | -- | |
| 荧光肽切割实验 | Mca-KAQPVEA-Lys(Dnp)肽 | GenScript | -- |
| CLARIOstar Plus酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 数据分析 | FCS Express 7软件 | De Novo Software | -- |
| GraphPad Prism 10软件 | GraphPad | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| UCSF ChimeraX软件 | -- | -- | |
| AlphaFold服务器 | -- | -- | |
| CLC Genomics Workbench软件 | Qiagen | -- | |
| ggplot2软件包 | -- | -- | |
| R软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | BFT处理浓度（1.5 ng/ml）和时间（1小时）、细胞数量、两轮选择条件、FACS分选门和抗体浓度 阅读提示：Methods: Screening CRISPR-KO Libraries |
| 细胞培养和敲除细胞系 | 细胞系来源、培养基、FBS浓度、敲除gRNA序列、筛选抗生素浓度、单克隆筛选方法 阅读提示：Methods: Cell lines, Stable cell line generation |
| BFT结合和E-钙黏蛋白切割实验 | BFT浓度（100 ng/ml）、处理时间（40分钟或2小时）、检测方法（流式、免疫印迹）、抗体克隆号 阅读提示：Methods: Cellular BFT binding assays, E-cadherin flow cytometry |
| T84单层TER实验 | 细胞 seeding 密度、培养时间、血清饥饿处理、BFT浓度（100 ng/ml 或2 ng/ml）、TER测量时间点和仪器校准 阅读提示：Methods: T84 monolayer culture and TER measurements |
| 小鼠盲肠注射实验 | 小鼠品系、性别、年龄、BFT和CLN4sol剂量、注射体积、麻醉和镇痛药物、取材时间 阅读提示：Methods: BFT caecal injection assay |