ATF4在肿瘤生长中的作用评估
评估ATF4是否在免疫健全和免疫缺陷宿主中对肿瘤生长具有不同影响
在KP GEMM中使用CRISPR-Cas9敲除Atf4，并在C57BL/6J和NSG小鼠中移植同基因KP、LLC和B16F10细胞系，监测肿瘤生长。
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综合应激反应通过脂质运载蛋白2促进免疫逃逸
The integrated stress response promotes immune evasion through lipocalin 2
实验完整度
高包含GEMM、同系移植瘤、CRISPR筛选、ExCITE-seq、流式、3D共培养、患者样本及抗体治疗等多层级验证，具备明确的功能和机制验证。
主要模型
KP肺腺癌细胞系 LLC肺癌细胞系 B16F10黑色素瘤细胞系 KPC7胰腺癌细胞系 KP GEMM肺腺癌模型 患者LUAD和PDAC组织样本
重点核对
在C57BL/6J、NSG和裸鼠中对比ATF4或LCN2缺失对肿瘤生长的影响 使用CRISPR-Cas9和shRNA系统进行基因敲除或敲低 通过ExCITE-seq分析肿瘤浸润免疫细胞组成 LCN2抗体治疗剂量为10 mg/kg，每周两次 患者样本中LCN2表达与TILs的相关性分析
摘要
癌细胞激活综合应激反应（ISR）以适应应激并抵抗治疗。ISR信号汇聚于激活转录因子4（ATF4），其控制参与代谢适应、生存和生长的细胞内在转录程序。然而，ISR–ATF4轴是否影响抗肿瘤免疫反应仍大多未知。这里我们显示，在免疫功能健全的小鼠中，ATF4缺失通过增强T细胞依赖性抗癌免疫反应显著减缓肿瘤进展，但在免疫功能低下的小鼠中则不然。对ATF4调控基因的无偏遗传筛选鉴定出脂质运载蛋白2（LCN2）是主要的ATF4依赖性效应因子，其通过促进免疫抑制性间质巨噬细胞的浸润来损害抗肿瘤免疫。此外，我们发现LCN2在临床前小鼠模型中促进T细胞排斥和免疫逃逸，并与肺腺癌和胰腺腺癌患者中T细胞浸润减少相关。抗LCN2抗体在侵袭性实体瘤小鼠模型中促进强烈的抗肿瘤T细胞反应。我们的研究表明，ATF4–LCN2轴在抑制抗癌免疫方面具有细胞外在作用，并可能为靶向LCN2的免疫治疗方法铺平道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ISR–ATF4轴是否影响抗肿瘤免疫反应，以及其下游效应因子如何介导免疫逃逸？
- 核心机制
- 肿瘤细胞通过ATF4直接调控LCN2表达，分泌的LCN2与巨噬细胞上的SLC22A17受体结合，促进免疫抑制性间质巨噬细胞积累，抑制CXCL9表达并增加IL-6，从而限制CD4+和CD8+ T细胞浸润，实现免疫逃逸。
- 主要证据
- 在KP、LLC、B16F10和KPC7等多种同系小鼠模型中，ATF4或LCN2缺失显著减缓肿瘤生长，而T细胞耗竭可逆转该效应；ExCITE-seq显示LCN2缺失改变巨噬细胞亚群和T细胞浸润；患者样本分析显示LCN2高表达与TILs减少和不良预后相关。
- 研究意义
- 该研究揭示了ISR–ATF4–LCN2轴在肿瘤免疫逃逸中的细胞外在作用，并提出靶向LCN2（如抗LCN2抗体）可能作为一种增强抗癌免疫的免疫治疗策略，用于治疗多种实体瘤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ATF4下游效应因子的筛选
鉴定介导ATF4免疫抑制功能的分泌因子
使用针对ATF4调控基因的定制CRISPR文库进行体内负向筛选，比较免疫健全和免疫缺陷小鼠中的sgRNA耗竭情况。
LCN2体内功能验证
验证LCN2在肿瘤生长和免疫逃逸中的作用
在KP、B16F10和KPC7等多种模型中敲除或敲低Lcn2，进行原位或皮下移植实验，并通过回补实验验证其功能。
LCN2表达调控机制研究
确定ISR–ATF4轴对Lcn2表达的调控机制
通过谷氨酰胺剥夺、衣霉素等ISR诱导剂处理细胞，结合ATF4 ChIP-qPCR和TCGA数据关联分析，验证ATF4直接调控Lcn2表达。
LCN2介导的免疫抑制微环境分析
阐明肿瘤来源的LCN2如何塑造免疫抑制性肿瘤微环境
利用ExCITE-seq、流式细胞术、免疫荧光和3D共培养等技术，分析LCN2缺失对肿瘤浸润免疫细胞（尤其是巨噬细胞和T细胞）的影响。
LCN2抗体的治疗评估
评估抗LCN2抗体在肿瘤模型中的治疗效果和机制
开发针对小鼠和人类LCN2的合成抗体，在KP LUAD和PDAC原位模型中进行治疗实验，评估肿瘤生长、生存期和T细胞浸润。
临床样本和数据库分析
评估LCN2表达与肿瘤分级、T细胞浸润和患者生存的临床相关性
对LUAD和PDAC患者组织微阵列进行LCN2和CD3免疫组化染色，结合TCGA等多个数据库进行生存分析和免疫表型关联分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 庆大霉素 | Gibco | -- | |
| 潮霉素 | Gibco | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| I型胶原蛋白 | Thermo Fisher Scientific | CB-40236 | |
| CellTracker深红染料 | Invitrogen | C34565 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 白细胞介素-2 | BioLegend | 575402 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15-630-106 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15-140-122 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11-140-050 | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| OptiMEM培养基 | Gibco | 31985062 | |
| 基因编辑 | PX458质粒 | Addgene | 48138 |
| pLKO.1-TETON-Puro质粒 | Addgene | 21915 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| JetPrime转染试剂 | -- | 101000046 | |
| 快速连接酶 | NEB | -- | |
| 动物实验 | D-荧光素 | Perkin Elmer | 122799 |
| 多西环素饮食 | Bio-Serv | S3888 | |
| ISRIB | -- | -- | |
| 苯乙双胍 | -- | -- | |
| CB-839 | -- | -- | |
| 衣霉素 | -- | -- | |
| 白细胞介素-1β | -- | -- | |
| 抗CD8抗体 | BioXcell | BE0061 | |
| 抗CD4抗体 | BioXcell | BE0119 | |
| 同型对照抗体 | BioXcell | BE0090 | |
| 抗PD1抗体 | BioXcell | -- | |
| 抗小鼠LCN2抗体 | -- | -- | |
| 抗人LCN2抗体 | -- | -- | |
| 组织学与免疫组化 | Leica BondRX自动染色机 | Leica | -- |
| 抗ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | 11815S, | |
| 抗LCN2抗体 | R&D Systems | AF1757, | |
| 抗CD3抗体 | Ventana Medical Systems | 790-4341, | |
| Opal荧光染料 | Akoya Biosciences | -- | |
| DAPI染色液 | Akoya Biosciences | FP1490 | |
| ProLong Gold防淬灭剂 | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| NIS-Elements软件 | Nikon | -- | |
| Hamamatsu NanoZoomer扫描仪 | Hamamatsu | 2.0-HT | |
| Leica AT2扫描仪 | Leica | -- | |
| Vectra Polaris多光谱成像系统 | Akoya | PhenoImager | |
| NIS-Elements图像分析软件 | Nikon | -- | |
| 免疫分析 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Zombie UV可固定活力染料 | BioLegend | 423107 | |
| Fc阻断剂 | BioXcell | -- | |
| FOXP3染色缓冲液试剂盒 | eBioscience | 00552300 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 泛单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-100-629 | |
| CD8a+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| T细胞激活/扩增试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-093-627 | |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 30-F11 | |
| 抗F4/80抗体 | -- | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13-778-075 | |
| 小干扰RNA | Qiagen | -- | |
| 重组LCN2蛋白 | -- | -- | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 抗CXCL9抗体 | -- | -- | |
| Luminex xMAP技术 | -- | -- | |
| 小鼠细胞因子/趋化因子32重检测试剂盒 | MilliporeSigma | MCYTOMAG-70K | |
| 蛋白分析 | Zymo-Spin ChIP试剂盒 | Zymo Research | -- |
| 蛋白G磁珠 | Invitrogen | 10-003-D | |
| 核糖核酸酶A | Qiagen | 19101 | |
| HisTrap excel层析柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex S75 Increase 10/300 GL分子筛 | Cytiva | -- | |
| 链霉亲和素传感器 | -- | -- | |
| 生物层干涉法 | Sartorius | Octet | |
| 多聚赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| BS(PEG)9交联剂 | Thermo Fisher Scientific | 21582 | |
| 亲和素 | Thermo Fisher Scientific | 21128 | |
| 三聚氰胺树脂微球 | Microparticles | MF-FluoRed-AR1286 | |
| 测序分析 | 10X Chromium单细胞测序平台 | 10x Genomics | -- |
| Cell Ranger软件 | -- | -- | |
| Seurat软件 | -- | -- | |
| MAGeCK算法 | -- | -- | |
| Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism统计软件 | -- | -- |
| Lunit SCOPE IO人工智能分析软件 | Lunit | -- | |
| 细胞培养 | Expi293F细胞 | -- | -- |
| 大肠杆菌55244菌株 | ATCC | -- | |
| 抗体开发 | Golden Gate组装 | NEB | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | KP细胞培养于含10% FBS和庆大霉素的RPMI培养基；Lcn2敲除细胞用潮霉素(800 μg/mL)维持；B16F10和LLC细胞培养条件需核实 阅读提示：检查Methods中的'Cell lines'部分 |
| 动物模型 | 使用C57BL/6J、NSG和裸鼠；KP细胞皮下注射剂量为100,000 cells/100 μL PBS；B16F10为2×10^5 cells；LLC为5×10^5 cells 阅读提示：检查Methods中的'Mouse models'部分 |
| ATF4敲除 | 使用PX458质粒转染，表达靶向Atf4的sgRNA，单克隆GFP阳性筛选并验证蛋白缺失 阅读提示：检查Methods中的'Cell lines'部分 |
| LCN2敲除与回补 | Lcn2敲除使用PX458质粒；回补使用慢病毒载体表达小鼠或人LCN2，并用潮霉素筛选 阅读提示：检查Methods中的'Cell lines'和'Cloning and virus generation'部分 |
| ISRIB治疗 | ISRIB剂量为2.5 mg/kg，每日腹腔注射 阅读提示：检查Methods中的'In vivo treatments'部分 |
| T细胞耗竭 | 大鼠IgG2b同型对照（LTF-2）或抗CD8（2.43）或抗CD4（YTS 191）抗体，剂量为150 μg，每周两次腹腔注射 阅读提示：检查Methods中的'In vivo treatments and T cell depletion'部分 |
| 抗体治疗 | 抗mLCN2、抗hLCN2和抗PD1抗体剂量均为10 mg/kg，抗PD1每周三次，其他每周两次；给药方式为腹腔注射 阅读提示：检查Methods中的'In vivo treatments'部分 |
| CRISPR筛选 | 使用477个ATF4靶基因的定制文库，包含3240条sgRNA，在C57BL/6J和NSG小鼠中皮下移植，12天后分析sgRNA耗竭 阅读提示：检查Methods中的'CRISPR screen'部分 |
| ExCITE-seq | CD45+细胞分选和10X Genomics单细胞测序，使用Seurat分析 阅读提示：检查Methods中的'ExCITE-seq'部分 |
| 巨噬细胞结合实验 | 使用LUMICKS AFS系统，BMDMs与mLCN2包被的聚苯乙烯微球共孵育 阅读提示：检查Methods中的'LUMICKS AFS'部分 |
| 3D共培养 | 2 mg/mL胶原蛋白I基质，BMDMs与KP细胞共培养2天，加入CD8 T细胞，48小时后成像 阅读提示：检查Methods中的'Infiltration of CD8 T cells in 3D matrices'部分 |
| 临床样本分析 | LUAD患者样本数为105，PDAC为33例；TMA样本进行LCN2和CD3染色 阅读提示：检查Methods中的'Histology analysis'部分 |
| TCGA数据分析 | 使用UCSC Xena平台获取RNA-seq数据；样品按LCN2表达四分位数分层 阅读提示：检查Methods中的'Correlation and stratified analysis'部分 |