IL23R变体筛选与功能鉴定
鉴定IL23R变体并评估其对IL-23信号通路的功能影响。
通过筛选患者队列和公共数据库发现变体，并在HEK293T细胞中过表达变体，用荧光素酶报告基因和Western blot检测STAT3磷酸化。
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罕见或常见IL23R亚效等位基因纯合子易患结核病
Humans homozygous for rare or common hypomorphic IL23R variants are prone to tuberculosis
实验完整度
高包含体外过表达实验、患者来源细胞系功能验证、单细胞转录组和群体遗传学关联分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞过表达体系 EBV-B细胞系 T细胞母细胞 外周血单个核细胞
重点核对
IL23R变体纯合子状态：G300V、G149R、R381Q、L372F IL-23刺激浓度：1、10、100 ng/ml IFN-γ产生检测：细胞内细胞因子染色、ELISA PBMC刺激时间：6、24、48小时 BCG感染实验：MOI=1
摘要
罕见IL23R功能缺失变体的纯合性消除了淋巴细胞（包括NK细胞和固有样T细胞）中IL-23依赖的IFN-γ产生，从而导致弱毒分枝杆菌引起的临床疾病。我们报告了在我们的结核病患者队列中，四个IL23R亚效变体的纯合性选择性富集。其中三个IL23R等位基因是罕见的（G300V、G149R和L372F），次要等位基因频率（MAF）低于1%，但第四个（R381Q）出人意料地常见，在某些人群中MAF高达10.2%。在公共数据库中以纯合状态发现的其他15个错义等位基因是同义的。这四种IL-23R亚效变体与IL-12Rβ1形成二聚体并结合IL-23。然而，由于其功能因细胞表面表达水平低（R381Q、G300V）和/或由于改变激动剂效力的构象变化而受损。IL-23刺激后，固有样T细胞和NK细胞中IFN-γ的产生受损。这些数据表明，隐性部分IL-23R缺陷，无论是由罕见还是常见变体引起，均易患结核病，同时保留对毒力较弱的分枝杆菌的免疫。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 罕见的或常见的IL23R变体纯合子是否导致结核病易感性，以及其潜在机制。
- 核心机制
- IL23R亚效变体导致部分IL-23R缺陷，损害IL-23依赖的IFN-γ产生，尤其是由MAIT、Vδ2+ γδ T和NK细胞产生的IFN-γ，从而增加结核病风险。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中过表达变体显示功能受损；患者来源的EBV-B细胞、T细胞母细胞和PBMC显示STAT3磷酸化和IFN-γ产生受损；单细胞RNA测序显示IFNG mRNA诱导受损；在结核病患者中富集纯合子。
- 研究意义
- 研究提示部分IL-23R缺陷是结核病的遗传风险因素，且对弱毒分枝杆菌的免疫力得以保留，为结核病遗传诊断和潜在治疗提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IL-23R变体表达与结合特性分析
评估变体对细胞表面表达、IL-23结合和受体二聚化的影响。
通过NanoLuciferase活性测定细胞表面表达，NanoBRET测定IL-23结合和受体相互作用。
患者来源细胞系的IL-23信号验证
验证在患者自身基因组背景下IL23R变体对IL-23信号的影响。
使用EBV-B细胞和T细胞母细胞，通过Western blot和流式细胞术检测STAT3磷酸化。
IL-23介导的IFNG mRNA诱导分析
评估IL23R变体对IL-23诱导IFNG mRNA表达的影响。
对PBMC进行单细胞RNA测序，分析IL-23刺激前后IFNG表达变化。
离体IFN-γ产生检测
评估IL23R变体对IL-23依赖的IFN-γ蛋白产生的影响。
用IL-23和/或IL-18、BCG刺激PBMC，通过流式细胞术和ELISA检测IFN-γ。
结核病患者纯合子富集分析
确定IL23R亚效变体纯合子是否在结核病患者中富集。
在结核病患者和对照队列中比较G300V、R381Q、G149R、L372F纯合子频率，进行logistic回归和负担检验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 荧光素酶报告基因实验 | pGL4.47(luc2P/SIE/Hygro)质粒 | Promega Corporation | -- |
| pRL-SV40质粒 | -- | -- | |
| X-tremeGENE 9 DNA转染试剂 | Roche | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 苯zonase | -- | -- | |
| Restore Western Blot剥离缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ECL试剂 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Bio-Rad ChemiDoc 成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| T细胞母细胞诱导 | ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基 | STEMCELL | -- |
| ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂 | STEMCELL | -- | |
| 重组人IL-2 | Novartis | -- | |
| RNA提取与RT-qPCR | Quick-RNA微量提取试剂盒 | Zymo | -- |
| High-Capacity RNA-to-cDNA试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| IL23R探针 | Applied Biosystems | Hs00332759_m1 | |
| GUSB探针 | Applied Biosystems | 4326320E | |
| NanoBRET配体结合实验 | FuGENE HD转染试剂 | Promega Corporation | -- |
| 氟利马嗪 | Promega Corporation | -- | |
| PHERAstar FS酶标仪 | BMG LabTech | -- | |
| NanoLuciferase表面表达检测 | NanoLuc胞外抑制剂 | Promega Corporation | -- |
| 发光成像 | Olympus LuminoView 200 显微镜 | Olympus | -- |
| C9100-23B IMAGE EMX2相机 | Hamamatsu | -- | |
| NanoBRET受体内部相互作用实验 | HaloTag 618配体 | Promega Corporation | -- |
| 突变诱导 | Phusion定点突变试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q5定点突变试剂盒 | NEB | E0554S | |
| NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒 | NEB | E5520S | |
| CloneAmp HiFi PCR预混液 | Takara | -- | |
| Dpn1限制酶 | -- | -- | |
| Sanger测序 | Big Dye Terminator v3.1试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Applied Biosystems 3500xL测序仪 | Thermo Fisher Scientific | A30469 | |
| 流式细胞术 | Aqua死细胞活力标记 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PE偶联抗CD212 (IL-12Rβ1)抗体 | BD Biosciences | 556065 | |
| LSRFortessa X-20流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| PBMC刺激 | 重组人IL-1β | R&D | -- |
| 重组人IL-23 | R&D | -- | |
| PMA（佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-醋酸酯） | Sigma-Aldrich | P1585-1MG | |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | 56092-81-0 | |
| 上清检测 | LEGENDplex多重ELISA试剂盒 | BioLegend | 740809 |
| BCG刺激 | 活卡介苗 | -- | -- |
| 重组人IL-12 | R&D Systems | -- | |
| 重组人IL-18 | R&D Systems | -- | |
| 重组人IL-23 | R&D Systems | 1290-IL | |
| GolgiPlug（布雷非德菌素A） | BD Biosciences | 555029 | |
| 流式细胞术（BCG刺激后） | Zombie NIR可固定活力试剂盒 | BioLegend | -- |
| Fc受体阻断剂 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 抗CD3-Alexa Fluor 532抗体 | eBioscience | 58-0038-42 | |
| 抗γδTCR-FITC抗体 | eBioscience | 11-9959-41 | |
| 抗Vδ2-APC/Fire 750抗体 | BioLegend | 331419 | |
| 抗CD56-BV605抗体 | BioLegend | 362537 | |
| 抗CD4-BV750抗体 | BD Biosciences | 566356 | |
| 抗CD8a-Pacific Blue抗体 | BioLegend | 344717 | |
| 抗Vα7.2 TCR-APC抗体 | BioLegend | 351708 | |
| 抗Vα24-Jα18-PE/Cy7抗体 | BioLegend | 342912 | |
| 抗CD20-BV785抗体 | BioLegend | 302356 | |
| 抗PD-1-PE抗体 | eBioscience | 12-9969-42 | |
| 核转录因子缓冲液套装 | BioLegend | -- | |
| 抗IFN-γ-BV711抗体 | BioLegend | 502540 | |
| 抗TNF-BV510抗体 | BioLegend | 502950 | |
| 抗IL-10-PE/Dazzle594抗体 | BioLegend | 506812 | |
| Aurora流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| 质谱流式细胞术 | Helios质谱流式细胞仪 | Fluidigm | -- |
| OMIQ软件 | -- | -- | |
| 单细胞RNA测序 | 40 µm孔径MACS细胞筛 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IL23R功能检测（荧光素酶报告基因） | HEK293T细胞转染IL23R和IL12RB1质粒，IL-23刺激浓度10 ng/ml，转染效率通过mCherry和IL-12Rβ1表达验证。 阅读提示：Methods: Luciferase reporter assay; Figure 1A |
| STAT3磷酸化检测（Western blot） | HEK293T或EBV-B细胞，IL-23刺激浓度1或10 ng/ml，刺激时间30分钟，抗体为抗pSTAT3。 阅读提示：Methods: Assessment of STAT3 phosphorylation by western blotting; Figure 1B, 2D |
| 细胞表面表达检测（NanoLuciferase） | HEK293T细胞转染NanoLuc标记的IL23R和IL12RB1，检测加入NanoLuc抑制剂前后的发光信号。 阅读提示：Methods: NanoLuciferase assays; Figure 2A |
| IL-23结合检测（NanoBRET） | HEK293T细胞转染NLuc IL-23R和IL-12Rβ1，使用IL-23-TAMRA进行结合实验，KD值。 阅读提示：Methods: NanoBRET ligand-binding assays; Figure 2C |
| PBMC刺激与IFN-γ检测 | PBMC分离方法，IL-23浓度（1、100 ng/ml），IL-18浓度（25、200 ng/ml），刺激时间（24、48小时），检测方法（流式或ELISA）。 阅读提示：Methods: Fresh PBMC stimulation, PBMC stimulation with BCG; Figures 4, 5 |
| 单细胞RNA测序 | PBMC刺激IL-23（100 ng/ml）6小时，数据分析和IFNG mRNA诱导计算。 阅读提示：Methods: PBMC stimulation for scRNAseq, Analysis of scRNAseq data; Figure 3 |