建立大鼠OIIRR模型
构建OIIRR体内模型，为正畸力诱导的牙根吸收研究提供动物基础。
将10只Wistar大鼠随机分为sham组和OIIRR组（n=5），使用正畸弹簧施加矫治力，7天后取材。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HDAC9介导的细胞焦亡促进正畸诱导的炎性牙根吸收
HDAC9-Mediated Pyroptosis Promotes Orthodontically Induced Inflammatory Root Resorption
实验完整度
高包含动物模型、细胞实验、转录组测序、CUT&Tag等多种证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
大鼠OIIRR模型 人牙周膜成纤维细胞 THP-1细胞诱导的破骨细胞前体
重点核对
大鼠品系为Wistar，雄性，体重190±15g，随机分为sham和OIIRR组，每组5只（n=5） hPDLFs过表达HDAC9后，经20µM VX765处理24小时进行焦亡抑制 hPDLFs与破骨细胞前体共培养时，使用含RANKL（50μg/mL）和M-CSF（50μg/mL）的条件培养基培养5天 转录组测序和CUT&Tag测序均使用3个生物学重复（n=3）
摘要
背景与目的：正畸诱导的炎性牙根吸收是正畸治疗常见的医源性后果。表观遗传修饰和细胞焦亡在OIIRR中均有一定作用。本研究旨在探讨表观遗传修饰是否调控细胞焦亡参与OIIRR。方法：建立大鼠OIIRR模型，取牙周组织进行H&E染色、TRAP染色、免疫荧光、转录组测序和RT-qPCR分析。对人牙周膜成纤维细胞过表达HDAC9，用细胞焦亡抑制剂处理，与破骨细胞共培养，并进行CUT&Tag测序。结果：正畸力增加了正畸牙齿移动距离和破骨细胞数量。转录组测序发现，与对照组相比，OIIRR大鼠牙周组织中Hdac9表达上调。免疫荧光显示HDAC9存在于牙周膜成纤维细胞中，与对照组相比，OIIRR组HDAC9荧光强度降低。在hPDLFs中过表达HDAC9可诱导细胞焦亡并促进破骨细胞分化。这些效应可被细胞焦亡抑制剂逆转。CUT&Tag分析显示，HDAC9过表达导致线粒体功能障碍相关通路上的脱乙酰化基因富集。CUT&Tag-PCR分析证实，HDAC9过表达后，线粒体功能障碍相关基因VPS13D、AQP1、PEX2、CDK1和PLEKHA1上的H3K9ac富集减少，RT-qPCR分析显示其相应表达水平下降。相应地，HDAC9过表达也增加了ROS水平。结论：HDAC9介导的组蛋白去乙酰化诱导hPDLFs线粒体功能障碍和细胞焦亡，从而促进破骨细胞分化和OIIRR进展。临床意义：本研究从表观遗传修饰的角度揭示了细胞焦亡在OIIRR中的调控机制，为OIIRR的发病机制提供了新的见解。关键词：HDAC9，细胞焦亡，牙周膜成纤维细胞，正畸诱导的炎性牙根吸收，线粒体功能障碍
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究表观遗传修饰是否通过调控细胞焦亡参与正畸诱导的炎性牙根吸收的发生与发展。
- 核心机制
- HDAC9介导的组蛋白去乙酰化导致hPDLFs线粒体功能障碍，ROS水平升高，进而激活NLRP3炎症小体，诱导细胞焦亡，释放IL-18和IL-1β，促进破骨细胞分化，最终促进OIIRR进展。
- 主要证据
- 大鼠OIIRR模型中，Hdac9在牙周组织表达上调；HDAC9过表达hPDLFs诱导焦亡并促进破骨细胞分化，VX765抑制焦亡后逆转此效应；CUT&Tag显示HDAC9过表达导致线粒体功能障碍相关基因（VPS13D、AQP1、PEX2、CDK1、PLEKHA1）H3K9ac富集减少且表达下调，同时ROS水平升高。
- 研究意义
- 本研究从表观遗传修饰角度揭示了细胞焦亡在OIIRR中的调控机制，为理解OIIRR发病机制提供新视角，并可能为OIIRR的防治提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组测序筛选关键表观遗传调控因子
通过转录组测序识别OIIRR牙周组织中差异表达基因，寻找参与OIIRR的表观遗传调控因子。
提取大鼠牙周组织RNA，进行转录组测序，分析DEGs，并通过RT-qPCR验证候选表观遗传相关基因的表达。
HDAC9过表达对hPDLFs焦亡及破骨细胞分化的影响
探究HDAC9在hPDLFs中是否诱导焦亡，并影响破骨细胞分化。
在hPDLFs中转染HDAC9过表达质粒，检测焦亡相关标志物（NLRP3、IL-18、IL-1β、LDH、细胞活性），并将过表达HDAC9的hPDLFs与THP-1细胞诱导的破骨细胞前体共培养，检测破骨细胞分化。
焦亡抑制对破骨细胞分化的影响
验证HDAC9诱导的焦亡是否介导了破骨细胞分化的促进作用。
在HDAC9过表达的hPDLFs中加入焦亡抑制剂VX765处理，检测破骨细胞分化指标。
CUT&Tag测序解析HDAC9调控的组蛋白修饰
在全基因组水平分析HDAC9过表达后H3K9ac修饰变化，寻找其直接调控的下游基因和通路。
对NC和HDAC9过表达hPDLFs进行CUT&Tag测序，分析H3K9ac peaks变化，并进行GO/KEGG富集分析，通过CUT&Tag-qPCR验证关键基因的H3K9ac富集程度，RT-qPCR验证基因表达。
线粒体ROS检测
验证HDAC9过表达是否诱导线粒体功能障碍，表现为ROS产生增加。
使用MitoSOX红色荧光探针检测HDAC9过表达hPDLFs中线粒体ROS水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
检测焦亡与线粒体功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 光固化型绿色凝胶釉质粘接剂迷你套装 | XIHUBIOM, China | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Sigma | T9424 |
| RNA建库 | Illumina mRNA测序文库制备试剂盒 | ABclonal | RK20302 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | CORNING | 10-013-CVR |
| 胎牛血清 | GIBCO | 10099-141 | |
| 青霉素/链霉素 | Sangon | E607011 | |
| 原代成纤维细胞培养基 | iCell | PriMed-iCell-003 | |
| 细胞处理 | 佛波酯 | Sigma | P8139 |
| 细胞转染与处理 | Lipofectamine™ 2000转染试剂 | Invitrogen | 1166019 |
| 细胞焦亡抑制 | VX765 | MCE | HY-13205 |
| 破骨细胞分化 | RANKL | Prospec | CYT-320 |
| M-CSF | MCE | HY-P7050 | |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | Thermo | K1622 |
| 2× Master Mix试剂盒 | Roche | 04913914001 | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Thermo | -- |
| CCK-8 assay | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0039 |
| 流式细胞术 | Annexin V凋亡检测试剂盒（FITC） | Sangon | E606336 |
| ROS检测 | Mitosox™红色荧光检测试剂盒 | Invitrogen | M36008 |
| 核染色 | Hoechst 33342 | Beyotime | C1025 |
| LDH检测 | LDH检测试剂盒 | Solarbio | BC0680 |
| CUT&Tag | Hyperactive In-Situ ChIP文库制备试剂盒 | Vazyme | TD901-TD902 |
| 抗H3K9ac抗体 | CST | 9649T | |
| AffiniPure山羊抗兔IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-005-144 | |
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5转座酶 | -- | 0.04 | |
| Western blotting | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Lg |
| 抗HDAC9抗体 | Santa | sc-398003 | |
| 抗NLRP3抗体 | ABclonal | A12694 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (HRP) | Abcam | ab205719 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| 免疫荧光 | 抗HDAC9抗体 | Santa | sc-398003 |
| 抗NLRP3抗体 | Serviebio | GB114320 | |
| 抗CD90抗体 | Abcam | ab307736 | |
| 抗OCN抗体 | Santa | sc390877 | |
| 抗TRAP抗体 | Abcam | ab191406 | |
| TRAP染色 | TRAP染色试剂盒 | Solarbio | G1492 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 大鼠品系、性别、体重、分组情况、麻醉剂量及方式、矫治器安装方式、取材时间 阅读提示：Methods: Animals, OIIRR model of rats |
| 转录组测序 | 样本量（n=3）、RNA提取方法、建库试剂盒、测序平台、DEGs筛选标准（|FC|>1.5, P<0.05） 阅读提示：Methods: RNA extraction and RNA sequencing |
| 细胞培养与传代 | 细胞系（THP-1、hPDLFs）来源、培养基组成、培养条件、细胞密度 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂、质粒用量、转染时间、细胞密度（90%融合度） 阅读提示：Methods: Cell transfection and treatment |
| 药物处理 | VX765浓度（20µM）、处理时间（24小时）、对照组处理（PBS） 阅读提示：Methods: Cell transfection and treatment |
| 破骨细胞分化共培养 | THP-1细胞PMA浓度（100ng/mL）和分化时间（48小时）、条件培养基制备（上清与培养基1:1）、RANKL和M-CSF浓度（50μg/mL）、共培养时间（5天） 阅读提示：Methods: Conditioned medium treatment |
| RT-qPCR | RNA提取方法、逆转录试剂盒、qPCR试剂盒、内参基因（GAPDH）、引物序列（表S1）、2^-ΔΔCt算法 阅读提示：Methods: RT-qPCR, Supplementary Table S1 |
| CUT&Tag | 细胞数量（n=1）、抗体（H3K9ac）、转座酶浓度、孵育时间、DNA提取和文库制备步骤 阅读提示：Methods: CUT&Tag |