构建基因编辑供体细胞
获得携带F9基因敲除或人F9敲入的正确基因修饰的猪胎儿成纤维细胞，作为体细胞核移植的供体。
设计并构建靶向猪F9基因5'UTR和外显子1的CRISPR/Cas9-sgRNA载体，以及含有人F9 CDS和同源臂的供体载体。将载体通过电穿孔转染猪胎儿成纤维细胞，通过有限稀释法筛选阳性克隆，并通过PCR和测序验证基因型。
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CRISPR/Cas9介导的人凝血因子IX敲入猪因子IX位点有效减轻血友病B猪的出血
CRISPR/Cas9-mediated knockin of human factor IX into swine factor IX locus effectively alleviates bleeding in hemophilia B pigs
实验完整度
高包含模型构建（CRISPR/Cas9+SCNT）、功能验证（凝血分析）、表型观察（自发出血）、病理组织学及影像学评估等多个独立证据层级。
主要模型
pF9敲除猪 hF9敲入猪 野生型猪
重点核对
猪模型构建：使用CRISPR/Cas9靶向猪F9基因5'UTR和外显子1，并通过体细胞核移植技术获得F0代猪。 基因型验证：通过PCR和Sanger测序确认pF9 KO猪的缺失突变和hF9 KI猪的敲入序列。 凝血功能评估：检测血浆FIX活性、APTT、PT及FIX抗原浓度。 自发出血监测：从出生至8周龄每日观察并记录自发出血事件（部位和频率）。 组织病理评估：对踝关节进行HE和Safranin O染色，评估滑膜炎和软骨退化。
摘要
血友病B是一种由凝血因子IX基因异常引起的X连锁隐性出血性疾病。若不进行预防性治疗，患者会经历频繁的自发性出血发作。特征明确的动物模型对于确定疾病的病理生物学和测试新型治疗方法非常有价值。在此，我们通过结合CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术，生成了一种血友病B（HB）猪模型。我们还通过基因插入测试了HB治疗的可能性。HB猪中频繁发生的自发性关节出血发作，使得对血友病性关节病的病理过程进行深入研究成为可能。与表现出严重出血倾向和关节损伤的HB猪相比，携带人凝血因子IX的转基因猪显示出出血的部分改善。总之，这项研究不仅为探索血友病性关节病的病理过程提供了一个转化型HB模型，也为未来通过原位基因组编辑永久性纠正血友病提供了可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探索CRISPR/Cas9介导的人F9基因敲入猪内源性F9位点是否能有效减轻血友病B猪的出血表型，并提供一个适合研究血友病性关节病的转化型大动物模型。
- 核心机制
- 通过CRISPR/Cas9介导的同源重组，将人F9编码序列定点整合到猪F9基因座，使猪能够表达并分泌人FIX，从而部分恢复凝血功能并减轻出血倾向。
- 主要证据
- pF9 KO猪表现出严重的FIX缺乏、APTT延长和频繁的自发性关节出血；hF9 KI猪则显示出人FIX mRNA和蛋白表达、血浆FIX活性部分恢复、APTT改善及自发性出血频率降低，组织学上滑膜炎和软骨退化也较轻。
- 研究意义
- 该研究提供了一种能自发发生关节出血的HB猪模型，适合深入研究血友病性关节病的病理过程；同时证明了原位基因插入替换缺陷基因的可行性，为未来血友病的永久性基因治疗提供了可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生成基因修饰猪模型
通过体细胞核移植技术，将基因修饰的供体细胞发育为完整的基因敲除或敲入猪。
将阳性供体细胞注入去核猪卵母细胞，激活重构胚胎后移植到同步化受体母猪体内，通过超声检查确认怀孕并分娩获得F0代猪。
验证基因修饰猪的凝血功能
评估pF9 KO和hF9 KI猪的FIX表达和凝血功能是否受到影响及人F9敲入后的改善效果。
采集猪血浆和肝组织，检测FIX活性、APTT、PT、FIX抗原浓度，并通过qRT-PCR和Western blot检测肝脏中猪源和人源FIX的mRNA和蛋白表达。
观察自发性出血表型
评估pF9 KO猪是否表现出血友病相关的自发出血，并比较hF9 KI猪的改善情况。
从出生至8周龄对猪只进行每日临床观察，记录自发性出血事件的数量、类型和部位。
评估血友病性关节病
通过组织学和影像学方法，评估pF9 KO猪关节损伤的病理特征，并比较hF9 KI猪的改善程度。
取2月龄猪的踝关节和肝脏进行组织学检查，通过HE和Safranin O染色评估滑膜炎和软骨退化；通过X射线影像评估骨骼改变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 |
| pLB载体 | TIANGEN | VT205 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 影像学 | 数字X射线成像系统 | Varian | PaxScan |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因编辑猪生成 | sgRNA靶序列、供体载体结构（hF9 CDS、同源臂）、细胞电穿孔参数、阳性克隆筛选方法 阅读提示：Methods中的Plasmid construction、Cell culture and selection，以及Online Supplementary Methods、Figure 1 |
| 凝血功能检测 | 血液采集方法、抗凝剂、检测试剂盒或方法、参考标准品、样本量（人n=3; WT n=4; KO n=4; KI n=3） 阅读提示：Methods中的Blood sampling and blood analysis、Figure 2及其图注 |
| 自发出血观察 | 观察周期（8周）、每日观察项目、出血事件定义、猪只饲养条件、样本量（WT n=2; KO n=5; KI n=3） 阅读提示：Methods中的Clinical observations、Results中的Clinical observations部分、Online Supplementary Table S3 |
| 组织学评估 | 组织固定（4%甲醛）、脱钙时间（3周）、切片厚度、染色步骤、评分标准（改良血友病滑膜炎评分） 阅读提示：Methods中的Histological assessment、Online Supplementary Table S1、Figure 4及其图注 |
| 影像学评估 | X射线成像设备、拍摄参数、关节部位（肘、肩、踝） 阅读提示：Methods中的Radiography、Figure 5及其图注 |