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        烟草吸烟通过诱导GAPDH琥珀酰化重编程细胞代谢以促进肺癌进展

        Tobacco Smoking Rewires Cell Metabolism by Inducing GAPDH Succinylation to Promote Lung Cancer Progression

        作者信息Kun Wang, Jingzhuo Li, Hai Zhang, Hongyan Ma, Hong-Yong Cui, Huai-Qiang Ju, Jing Zhang, Qing-Zhi Ma, Ming Zhao, Qing-Mei Zeng, Jie Zou, Xiu-Xuan Sun, Gang Nan, Meirui Qian, Lin Jing, Yiming Li, Cai-Feng Xiong, Qiu-Zi Yang, Hao Wang, Jian-Li Jiang, Zhi-Nan Chen, Liang Chen, Wan Huang
        PMID40366632
        期刊Cancer Res
        发布时间2025-08-01
        DOI10.1158/0008-5472.CAN-24-3525
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含临床样本蛋白质组学、细胞系功能实验、转基因小鼠模型及代谢组学等多层次验证，涵盖机制研究（p300催化、TRIM4泛素化）与体内肿瘤生长转移评估。

        主要模型

        A549 人肺腺癌细胞系 NCI-H2170 人肺鳞状细胞癌细胞系 KrasG12D驱动的NSCLC小鼠模型 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型

        重点核对

        吸烟状态与GAPDH K251-Su水平相关性（IHC，吸烟者高于非吸烟者） CSE处理浓度（缺氧/营养缺乏条件下0%-15%） 谷氨酰胺浓度（0.5和6 mmol/L）及处理时间（24小时） p300抑制剂A485浓度（2 μmol/L）及处理时间（24小时） 小鼠模型中AAV6-Cre及AAV6-Gapdh WT/K251R滴度及注射时间

        摘要

        患者行为与生理状态可直接影响癌症代谢。吸烟是非小细胞肺癌（NSCLC）的主要危险因素。在本研究中，我们确定了吸烟通过改变蛋白质翻译后修饰来调节肺癌细胞代谢。蛋白质组学分析在NSCLC样本中鉴定到糖酵解关键酶GAPDH的K251位点琥珀酰化（K251-Su）升高，并且吸烟患者的GAPDH K251-Su水平显著高于不吸烟者。将肺癌细胞暴露于香烟烟雾提取物导致谷氨酰胺摄取增加和GAPDH K251-Su增强。在缺氧和营养缺乏的微环境中，癌细胞对谷氨酰胺的摄取为GAPDH在K251位点的琥珀酰化提供了琥珀酰辅酶A供体，该过程由酰基转移酶p300催化。K251-Su通过抑制TRIM4介导的K254泛素化增加GAPDH稳定性。GAPDH K251-Su增强了糖酵解和谷氨酰胺还原羧化，以满足细胞生长需求并支持在缺氧和营养耗竭条件下的存活，促进肿瘤生长和转移。这些发现表明，烟草吸烟通过GAPDH的琥珀酰化介导癌细胞的代谢重编程，从而驱动NSCLC进展。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        吸烟如何通过蛋白质翻译后修饰重编程肺癌细胞代谢，进而促进NSCLC进展？
        核心机制
        吸烟导致癌细胞在缺氧和营养缺乏微环境中摄取谷氨酰胺增加，提供琥珀酰辅酶A供体，由p300催化GAPDH K251琥珀酰化，通过抑制TRIM4介导的K254泛素化增强GAPDH蛋白稳定性，进而促进糖酵解和谷氨酰胺还原羧化，支持肿瘤生长与转移。
        主要证据
        临床样本蛋白质组学鉴定GAPDH K251-Su在吸烟者肿瘤组织中升高；细胞实验证明CSE和谷氨酰胺增强GAPDH K251-Su；p300敲低或抑制降低琥珀酰化；GAPDH K251突变抑制糖酵解和谷氨酰胺还原羧化；KrasG12D小鼠模型显示GAPDH K251-Su促进肿瘤生长与转移。
        研究意义
        该研究揭示了吸烟通过蛋白质琥珀酰化重编程代谢的新机制，提示戒烟可能作为靶向癌症代谢的潜在策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        临床样本与蛋白质组学分析

        鉴定NSCLC肿瘤组织中差异表达的蛋白质和琥珀酰化修饰位点，并探究GAPDH K251-Su与吸烟及预后的关系。

        收集NSCLC患者肿瘤及癌旁组织（n=14）进行质谱分析，鉴定GAPDH琥珀酰化位点。通过IHC在90例肺鳞癌和92例肺腺癌组织芯片中检测GAPDH K251-Su表达，并分析其与临床病理参数及吸烟状态的相关性。

        2

        细胞水平验证烟刺激效应

        验证香烟烟雾提取物（CSE）对谷氨酰胺摄取和GAPDH K251-Su水平的影响。

        使用不同浓度CSE处理A549细胞，在缺氧/营养缺乏或常氧/营养充足条件下检测GAPDH K251-Su水平；用谷氨酰胺比色法测定细胞内谷氨酰胺浓度；去除或添加不同氨基酸检测对GAPDH K251-Su的影响。

        3

        机制探究：GAPDH K251-Su对蛋白稳定性的调控

        探究GAPDH K251-Su如何影响GAPDH蛋白稳定性及其分子机制。

        构建GAPDH WT和K251R/E突变体，检测蛋白表达和泛素化水平；使用MG132和放线菌酮处理检测蛋白降解速率；通过质谱鉴定K254泛素化位点；通过co-IP验证GAPDH与E3连接酶TRIM4的相互作用。

        4

        鉴定催化GAPDH K251-Su的酰基转移酶

        确定催化GAPDH K251琥珀酰化的酶。

        通过siRNA敲低GCN5、CPT1A、DLST、p300/CBP，检测GAPDH K251-Su水平；通过免疫荧光和共免疫沉淀验证GAPDH与p300的共定位和相互作用；使用p300抑制剂A485验证其对GAPDH K251-Su的影响。

        5

        代谢表型分析

        评估GAPDH K251-Su对糖酵解和谷氨酰胺代谢的影响。

        使用Seahorse分析仪测量OCR和ECAR，进行糖酵解应激测试、线粒体应激测试、谷氨酰胺氧化应激测试和ATP产生速率测试；使用U-13C5标记谷氨酰胺进行代谢流追踪。

        6

        体内功能验证

        验证GAPDH K251-Su对NSCLC肿瘤生长和转移的影响。

        建立KrasG12D驱动的NSCLC小鼠模型（AAV6-Cre和AAV6-Gapdh WT/K251R），通过micro-CT和PET-CT成像监测肿瘤进展；解剖评估肿瘤负荷和转移；通过皮下移植瘤模型验证体内生长能力。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        质谱分析免疫组化
        验证细胞功能变化
        CCK-8细胞增殖检测克隆形成实验划痕实验
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹实时荧光定量PCR
        验证免疫效应
        免疫组化
        验证机制链路
        免疫沉淀免疫共沉淀免疫荧光染色
        评估体内效果
        微型计算机断层扫描正电子发射断层扫描/计算机断层扫描苏木精-伊红染色
        数据分析与统计
        Kaplan-Meier生存分析Cox回归分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养RPMI-1640培养基文中未明确说明--
        胎牛血清文中未明确说明--
        青霉素/链霉素文中未明确说明--
        L-谷氨酰胺Sangon BiotechA100374
        药物处理A485MedChemExpressHY-107455
        蛋白稳定性检测MG132Cayman Chemical13697
        蛋白提取RIPA裂解液Beyotime BiotechnologyP0013
        去乙酰化酶抑制去乙酰化酶抑制剂混合物Beyotime BiotechnologyP1113
        转染Lipofectamine 2000转染试剂Thermo Fisher Scientific11668019
        细胞培养L-谷氨酸Sangon BiotechA600221
        L-蛋氨酸Sangon BiotechA610346
        L-脯氨酸Sangon BiotechA600923
        L-缬氨酸Sangon BiotechA600172
        L-亮氨酸Sangon BiotechA600922
        L-异亮氨酸Sangon BiotechA600914
        谷氨酰胺检测谷氨酰胺比色检测试剂盒Elabscience BiotechnologyE-BC-K853-M
        代谢物检测人琥珀酰辅酶A ELISA检测试剂盒MLBio BiotechnologyML716772-2
        细胞增殖检测CCK-8细胞增殖检测试剂盒EnoGeneE1CK-00208
        RNA提取RNA提取试剂盒Omega Bio-tekD6934-01
        反转录PrimeScript逆转录试剂盒TakaraRR037A
        实时荧光定量PCRTB Green荧光染料TakaraRR8820
        PCR支原体检测PCR支原体检测试剂盒Takara6601
        免疫沉淀Pierce交联免疫沉淀试剂盒Thermo Fisher Scientific26147
        免疫共沉淀Pierce免疫共沉淀试剂盒Thermo Fisher Scientific26149
        抗体抗琥珀酰赖氨酸抗体PTM BIOPTM-419
        抗GAPDH K251-Su抗体PTM BIO本文定制
        抗GAPDH抗体Proteintech60004-1-Ig
        抗Flag标签抗体Proteintech66008-3-Ig
        抗His标签抗体Proteintech66005-1-Ig
        抗微管蛋白抗体Proteintech66031-1-Ig
        抗泛素抗体Proteintech10201-2-AP
        抗TRIM4抗体Sino Biological204421-T44
        抗TRIM21抗体Santa Cruz Biotechnologysc-25351
        抗TRIM23抗体Santa Cruz Biotechnologysc-393923
        抗CBP抗体Santa Cruz Biotechnologysc-7300
        抗p300抗体Abcamab275378
        抗DLST抗体Abcamab177934
        抗CPT1A抗体Abcamab220789
        抗GCN5抗体Abcamab217876
        二抗山羊抗小鼠IgG二抗，HRP标记Thermo Fisher Scientific31430
        山羊抗兔IgG二抗，HRP标记Thermo Fisher Scientific31460
        免疫组化抗Ki67抗体Abcamab15580
        抗CD31抗体Abcamab28364
        抗eGFP抗体Thermo Fisher ScientificCAB4211
        通用SP检测试剂盒ZSGB-BIOSP-9000
        DAB显色液ZSGB-BIOZLI-9019
        代谢组学ACQUITY UPLC/Xevo TQ-XS 超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪Waters CorporationRRID:
        BEH C18分析柱Waters--
        UPLC HILIC色谱柱（Amide XBridge）Waters--
        蛋白质谱EASY-nLC 1000 超高效液相色谱系统Thermo Fisher Scientific--
        Q Exactive Plus 质谱仪Thermo Fisher ScientificRRID:
        LTQ质谱仪Thermo Fisher ScientificRRID:
        Western blot聚偏二氟乙烯膜Millipore--
        Gel Doc EZ 凝胶成像仪Bio-Rad--
        实时荧光定量PCRABI 7200实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems--
        MiniOpticon实时荧光定量PCR仪Bio-Rad--
        Seahorse实验Seahorse XFe96 细胞能量代谢分析仪Agilent TechnologiesRRID:
        Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒Agilent Technologies103015-100
        Seahorse XF谷氨酰胺氧化应激测试试剂盒Agilent Technologies103674-100
        Seahorse XF实时ATP速率检测试剂盒Agilent Technologies103592-100
        Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒Agilent Technologies103020-100
        体内成像微型CT成像系统（Quantum GX2）PerkinElmerRRID:
        PET/CT成像系统（MadicLab PSA094）Shandong Madic TechnologyRRID:
        代谢物示踪均匀标记13C的谷氨酰胺Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-1822-H

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞处理
        CSE浓度（0%-15%）、谷氨酰胺浓度（0.5和6 mmol/L）、缺氧条件（2% O2）、营养缺乏（1% FBS，0.5 g/L葡萄糖）、处理时间（24小时）
        阅读提示：见Materials and Methods中的Cigarette smoke extract preparation和Glutamine colorimetric assay，以及Figure 2 legend
        蛋白稳定性检测
        MG132处理时间（0、6、12小时）、CHX处理时间（0、8、16小时）、突变体（K251R、K251E、K254R、K251R/K254R）
        阅读提示：见Results部分GAPDH K251-Su increases stable expression...及Figure 3 legend
        p300催化活性验证
        siRNA序列（针对p300等）、A485浓度（2 μmol/L）、处理时间（24小时）
        阅读提示：见Results部分Acyltransferase p300 catalyzes...及Figure 4 legend
        代谢分析
        Seahorse实验细胞数（10,000/孔）、谷氨酰胺浓度（0.5和6 mmol/L）、缺氧/营养缺乏条件、抑制剂（oligomycin、FCCP、rotenone/antimycin、BPTES）浓度
        阅读提示：见Materials and Methods中的Seahorse XF cellular mitochondrial stress test...及Figure 5 legend
        体内动物模型
        小鼠品系及周龄（KrasG12D，6-8周；BALB/c裸鼠4周）、病毒滴度（AAV6-Cre 3e11，AAV6-Gapdh 5e11）、注射时间（AAV6-Gapdh在AAV6-Cre后1周）、肿瘤测量频率（每3天）、CT成像参数
        阅读提示：见Materials and Methods中的Establishment of KrasG12D-driven NSCLC GAPDH WT/K251R mouse model和Establishment of NSCLC nude mouse model

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