单核RNA测序及肿瘤细胞组分分析
鉴定化疗后残余的恶性持久细胞并分析化疗对肿瘤细胞组成的影响
对20对匹配的诊断和手术样本进行snRNA-seq，整合248,591个细胞核，通过inferCNV和标志基因鉴定恶性细胞，比较诊断和手术时各细胞类型比例变化。
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化疗耐药的高危神经母细胞瘤持久细胞的鉴定与特征描述
Identification and Characterization of Chemotherapy-Resistant High-Risk Neuroblastoma Persister Cells
实验完整度
高包含患者配对样本snRNA-seq与WGS、PDX模型、细胞系功能验证及体内异种移植实验等多层级验证。
主要模型
患者配对肿瘤样本（诊断与手术） PDX小鼠模型（COG-424x、COG-496x） 神经母细胞瘤细胞系（LAN5、IMR5、SKNSH、SHEP、BE2C等） NSG小鼠异种移植模型（BE2-LUC+TAMs+CAFs）
重点核对
MYCN扩增状态及ALK/TP53突变状态与持久细胞亚型的关联 化疗药物处理方案（topotecan、etoposide的IC90剂量及3周间隔模拟临床） NFκB活性抑制（JSH-23、ML120B）对细胞存活的影响 TAMs和CAFs条件培养基对NFκB活性和耐药性的增强作用
摘要
高危神经母细胞瘤的复发率仍然极高。导致复发的恶性细胞尚未被鉴定，治疗耐药的机制仍知之甚少。在本研究中，我们使用单核RNA测序和批量全基因组测序来鉴定和表征化疗后存活的残留恶性持久细胞，这些细胞来自20对匹配的诊断和根治性手术肿瘤样本，这些患者接受了高危神经母细胞瘤诱导化疗。我们显示，持久细胞共享化疗逃逸的常见机制，包括抑制MYC(N)活性和激活NFκB信号传导，后者还通过恶性细胞与肿瘤微环境之间的细胞间通讯进一步增强。总体而言，我们的工作解析了高危神经母细胞瘤细胞持续存在的转录景观，并为开发新的治疗策略以预防疾病复发铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 高危神经母细胞瘤中化疗后存活的持久细胞的特性及其耐药机制是什么？
- 核心机制
- 持久细胞通过抑制MYC(N)活性和激活NFκB信号，后者由肿瘤细胞内在和外在因素触发，介导细胞持续存在和化疗耐药。
- 主要证据
- 基于20对诊断和手术样本的snRNA-seq和WGS，鉴定出四种持久细胞亚型；体外实验显示NFκB活性与耐药相关，CRISPR-Cas9敲除RelA降低细胞存活；体内实验显示抑制NFκB核转位可阻止肿瘤进展。
- 研究意义
- 抑制这些通路及其下游效应子被推测可消除持久细胞并预防复发，为开发新的治疗策略提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
持久细胞亚型鉴定
根据信号通路激活模式定义持久细胞的转录程序
对86,901个持久细胞核进行基于通路的聚类，使用VISION计算52条hallmark通路得分，选择9条最信息通路进行Louvain聚类，并用Hotspot鉴定基因模块，得到四种持久细胞亚型。
遗传改变分析
评估诊断时遗传改变对持久细胞表型的影响
对肿瘤对进行批量WGS，比较诊断和手术样本的CNV和SNV，并将持久细胞亚型与MYCN扩增、ALK/TP53突变、11q缺失等遗传事件关联。
MYC(N)活性抑制验证
验证非增殖持久细胞中MYC(N)活性被抑制
通过GSEA比较非增殖和增殖持久细胞的差异表达基因，显示MYC(N)靶基因是最显著负富集通路；使用IF/IHC验证TOP2A和MKI67蛋白下降；在PDX模型和细胞系中验证化疗后MYCN/MYC蛋白下降。
NFκB激活机制研究
研究NFκB信号在持久细胞中的作用及上游激活因素
使用GFP报告基因检测基础NFκB活性，发现与topotecan耐药相关；CRISPR-Cas9敲除RelA降低细胞存活；用PRRX1诱导间充质转化证明间充质状态与NFκB激活相关；化疗或TAM/CAF条件培养基可诱导NFκB活性。
体内验证NFκB抑制效果
验证抑制NFκB可消除持久细胞并阻止肿瘤进展
NSG小鼠皮下注射BE2-LUC细胞+人TAMs和CAFs，用etoposide加或不加JSH-23处理，测量生物发光和肿瘤大小。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| snRNA-seq文库制备 | Chromium单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 测序平台 | Novaseq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 核提取 | 杜恩斯匀浆器 | Millipore Sigma | D8938 |
| 核过滤 | 40微米细胞过滤器 | Falcon | 352340 |
| WGS文库制备 | Quick-DNA微量制备加试剂盒 | Zymo Research | D4074 |
| Illumina DNA制备（M）标签化试剂盒 | Illumina | 20018705 | |
| Nextera DNA CD索引试剂盒 | Illumina | 20018707 | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 药物处理 | 拓扑替康 | Teva | -- |
| 依托泊苷 | Teva | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| Western blot | 细胞裂解液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 磷酸酶抑制剂混合物2 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| NuPage LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 4-12% Bis-Tris凝胶 | Life Technologies | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SuperSignal West Femto化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| c-MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 18583 | |
| N-MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 9405 | |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | 4767 | |
| PRRX1抗体 | OriGene | TA803116 | |
| YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| PHOX2B抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376997 | |
| DLK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2069 | |
| TUB抗体 | Calbiochem | CP06 | |
| RT-PCR | Direct-zol RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R2062 |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| MYCN Taqman基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232074 | |
| MYC Taqman基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | HS00153408 | |
| GAPDH Taqman基因表达检测 | Thermo Fisher Scientific | HS999905 | |
| Applied Biosystems 7900HT序列检测系统 | Applied Biosystems | -- | |
| NFκB GFP报告基因 | NFκB GFP慢病毒 | BPS Bioscience | 79926 |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| CRISPR-Cas9敲除 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 |
| PMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| RelA质粒 | Addgene | 83944 | |
| 转分化实验 | pLVX-TetOne载体 | Takara | 631847 |
| NFκB pNifty2-Luc报告质粒 | Invivogen | -- | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Bright-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | E2610 | |
| IF共聚焦显微镜 | CD44抗体 | Cell Signaling Technology | 3579 |
| Alexa Fluor二抗 | Invitrogen | A32744 | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜（TCS SP8） | Leica | -- | |
| 共培养实验 | Transwell小室（0.4微米孔径） | Corning | -- |
| Iscove改良Dulbecco培养基 | -- | -- | |
| JSH-23 | Selleckchem | -- | |
| 体内实验 | NOD/SCID gamma小鼠 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | ML120B | Tocris | 4899 |
| JSH-23 | MedChemExpress | 13982 | |
| 测序平台 | Countess细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 链霉素/青霉素 | -- | -- | |
| 细胞系鉴定 | GenePrint 24系统 | Promega | -- |
| 细胞处理 | 甲醛缓冲液 | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Tween-20 | -- | -- | |
| 鬼笔环肽 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本处理 | 样本类型（诊断活检与手术切除）、患者治疗方案（诱导化疗方案、是否接受131I-MIBG等）、样本采集时间点（诊断、手术、复发） 阅读提示：Methods: Patient Samples and Ethics; Results: 引言部分 |
| snRNA-seq | 组织解离和核提取条件（Nuclear Extraction Buffer配方、匀浆次数）、文库制备试剂盒版本、测序平台、数据过滤参数（去除双细胞、线粒体比例等）、细胞类型注释方法 阅读提示：Methods: Sample Dissociation and Nuclei Isolation, snRNA-seq Library Preparation and Sequencing, Quality Control and Preprocessing |
| 持久细胞亚型分类 | 通路得分计算方法、通路选择标准（C>0.5, FDR<0.01）、Hotspot参数、meta-modules定义及基因列表 阅读提示：Methods: Pathway-Based Clustering, Identifications of Gene Module and Persister Subtype Assignment; Supplementary Table S3 |
| WGS分析 | DNA提取方法、文库制备试剂盒、测序平台、比对和变异检测软件、CNV和SNV过滤参数 阅读提示：Methods: WGS, Copy Number Detection in WGS Data, SNV Calling in WGS Data |
| 细胞系实验 | 细胞系来源、培养条件、药物处理剂量和时间（IC90、处理天数）、细胞活力检测方法 阅读提示：Methods: Cell Lines, Drug Studies |
| PDX实验 | PDX模型来源（COG-424x, COG-496x）、小鼠品系和年龄、肿瘤接种方式、化疗给药方案（topotecan和cyclophosphamide剂量、时间）、肿瘤收集时间点 阅读提示：Methods: PDX |
| 体内NFκB抑制实验 | 细胞系（BE2-LUC）、TAMs/CAFs获取方法、细胞注射比例和数量、药物处理方案（etoposide和JSH-23剂量、时间）、肿瘤测量方法 阅读提示：Methods: Drug Response of the Xenotransplanted Model |
| NFκB活性检测 | 报告基因类型（GFP或荧光素酶）、细胞处理条件、检测方法 阅读提示：Methods: NFκB GFP Reporter Assay, Transdifferentiation Assays |
| 共培养实验 | 细胞比例（4:4:1 NB:MN:MSC）、培养基、处理时间、JSH-23浓度 阅读提示：Methods: Coculture Experiments |