供体胰腺样本获取与组织处理
获得无热缺血时间的高质量健康人胰腺样本，用于后续分析。
通过Gift of Life Michigan获取30例脑死亡供体胰腺，在保持血流的情况下交叉钳夹血管，快速冷却并运输至实验室，进行组织处理和分配用于组织病理、单细胞测序和空间转录组学。
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供体胰腺分析定义了早期肿瘤性病变的转录组特征和微环境
Analysis of Donor Pancreata Defines the Transcriptomic Signature and Microenvironment of Early Neoplastic Lesions
实验完整度
高结合组织病理学、多重免疫组化、单细胞RNA测序、空间转录组学及KRAS突变检测，实现从组织形态到转录组的多层级验证。
主要模型
30例脑死亡供体胰腺（无已知胰腺疾病） PDAC肿瘤样本及邻近正常组织
重点核对
供体器官获取方式：DBD（脑死亡后捐献）以保持器官血流。 单细胞RNA测序的样本量：6个供体胰腺，共44,068个细胞。 空间转录组学ROI的选取：基于病理学确认的腺泡、正常导管、ADM和PanIN区域。 KRAS突变检测：使用数字液滴PCR检测G12D、G12R和G12V突变。
摘要
健康的成人人类胰腺由于在无疾病状态下缺乏获取组织的指征以及死后快速降解，一直研究甚少。我们获得了来自脑死亡供体的胰腺，从而避免了任何热缺血时间。30名供体在年龄和种族上多样化，且没有已知的胰腺疾病。样本的组织病理学分析显示，大多数个体无论年龄大小都存在胰腺上皮内瘤变（PanIN）病变。结合多重免疫组化、单细胞RNA测序和空间转录组学，我们首次描述了成人人类胰腺和散发性PanIN病变的独特微环境。我们将健康胰腺与胰腺癌及肿瘤周围组织进行比较，观察到成纤维细胞以及较小程度上的巨噬细胞具有不同的转录组特征。来自健康胰腺的PanIN上皮细胞与癌细胞在转录上惊人地相似，表明肿瘤发生途径在肿瘤形成的早期就已启动。意义：胰腺癌的前体病变特征尚不明确。我们分析了供体胰腺，发现前体病变的检出率远高于胰腺癌的发病率，这将为阐明限制或促进恶性进展的微环境和细胞内在因素奠定基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 健康成人胰腺中是否存在早期肿瘤性病变（如PanIN），其微环境和转录组特征与胰腺癌有何异同？
- 核心机制
- 研究提出PanIN病变的启动可能涉及早期激活的肿瘤发生途径，但其微环境（包括成纤维细胞和免疫细胞）可能促进或抑制其进展，具体机制尚待阐明。
- 主要证据
- 基于30例健康供体胰腺的组织病理学、mfIHC、单细胞RNA测序和空间转录组学分析，显示PanIN在大多数供体中存在，其上皮细胞转录组与癌细胞高度相似，且其微环境富含成纤维细胞、髓系细胞和T细胞。
- 研究意义
- 研究揭示PanIN在普通人群中的高发生率，为未来探索限制或促进恶性进展的微环境和细胞内在因素提供了基础，并可能为早期检测和治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织病理学评估
鉴定健康胰腺中的PanIN病变及其他组织学特征。
对每个供体胰腺的15个组织块进行H&E染色，评估PanIN、正常腺泡、导管和ADM的存在。
多重免疫荧光（mfIHC）微环境分析
比较PanIN病变周围与正常区域的免疫细胞和成纤维细胞组成。
使用免疫和成纤维细胞抗体面板进行mIHC，量化不同区域中CD163+巨噬细胞、CD4/CD8 T细胞、Tregs以及SMA、vimentin、FAP、PDGFR等成纤维细胞标志物的阳性细胞比例。
单细胞RNA测序
解析健康胰腺的细胞组成和转录组特征，并与肿瘤样本比较。
对6个供体胰腺（其中5个分为头尾样本）进行单细胞RNA测序，经过质量控制、整合和聚类，注释细胞类型，并进行差异丰度和差异表达分析。
空间转录组学分析
直接获取PanIN及其周围区域的上皮细胞转录组信息，弥补单细胞测序丢失空间信息的不足。
使用NanoString GeoMx平台对供体胰腺和PDAC样本中的腺泡、正常导管、ADM、PanIN和肿瘤区域进行ROI选取，经过PanCK和CD45分段，进行转录组测序和差异表达分析，得到细胞类型特异性特征。
验证实验
验证空间转录组学得到的细胞类型特异性标志物在蛋白水平的表达。
对供体胰腺切片进行共免疫荧光和RNAscope，检测AQP1、MUC5B、AQP3、CLDN18、MUC5AC、TFF1和p-ERK的表达，以区分正常导管、ADM和PanIN。
KRAS突变检测
评估PanIN病变是否存在KRAS突变及其多克隆性。
从FFPE组织中提取gDNA，使用数字液滴PCR检测KRAS G12D、G12R和G12V突变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织处理 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Y27632 | -- | -- | |
| 组织消化 | 胶原酶P | -- | -- |
| 组织固定 | 福尔马林 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 多重免疫荧光 | Vectra Polaris工作站 | Akoya Biosciences | -- |
| 多重免疫荧光定量 | Mantra定量病理工作站 | Akoya Biosciences | -- |
| 多重免疫荧光分析 | inForm细胞分析软件 | Akoya Biosciences | -- |
| RNAscope | 共检测抗体稀释液 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| ProteasePlus试剂 | Advanced Cell Diagnostics | -- | |
| RNAscope洗涤缓冲液 | Advanced Cell Diagnostics | -- | |
| TSA试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | -- | |
| 免疫荧光 | TSA试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Leica Stellaris 8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 单细胞RNA测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| Cell Ranger软件 | 10x Genomics | -- | |
| KRAS突变检测 | QIAamp DNA FFPE组织试剂盒 | Qiagen | 56404 |
| QX200数字PCR系统 | Bio-Rad | 1864001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 供体样本获取 | 供体来源、DBD（脑死亡后捐献）条件、器官保存液的种类和冷却温度 阅读提示：Methods: Donor Sample Procurement |
| 组织处理 | 组织切割至1mm3大小、胶原酶P浓度（1mg/mL）和消化时间（20-30分钟）、过滤网规格（40μm） 阅读提示：Methods: Tissue Processing |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics平台、测序深度（100,000 reads/细胞）、Cell Ranger版本和参考基因组（GRCh38）、质量控制阈值（线粒体>15%或基因<200）、整合方法（rPCA） 阅读提示：Methods: Single-Cell RNA Sequencing |
| 空间转录组学 | ROI选择标准（基于病理学确认）、分段策略（PanCK/CD45）、归一化方法（Q3）和批次效应校正方法（limma） 阅读提示：Methods: Spatial Transcriptomics Data Analysis |
| 免疫荧光验证 | 抗体稀释度（如CLDN18 1:100, AQP1 1:500等）、抗原修复条件（pH 6.0或pH 9.0缓冲液）、TSA试剂盒品牌 阅读提示：Methods: Immunofluorescence Assessment with Tyramide Signal Amplification |
| KRAS突变检测 | gDNA上样量（9 ng）、ddPCR循环条件（95°C 10分钟；40个循环94°C 30秒，55°C 1分钟；98°C 10分钟；4°C保持）、探针ID（G12D-dHsaCP2000001等） 阅读提示：Methods: Detection of KRAS Mutations by Digital Droplet PCR |