建立EGFR驱动的小鼠肺癌模型
建立可诱导的EGFR突变体驱动的肺腺癌小鼠模型，并引入Cas9以进行体细胞基因编辑。
使用TetO-EGFRL858R、R26RIK和p53flox/flox等位基因，通过慢病毒-Cre感染启动肿瘤，并验证肿瘤的病理特征和标志物表达。
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EGFR驱动的肺癌生长和治疗反应的体内遗传决定因素
Genetic Determinants of EGFR-Driven Lung Cancer Growth and Therapeutic Response In Vivo
实验完整度
高包含体内小鼠模型（EGFR;p53;Cas9）和人类临床队列验证，结合CRISPR-Cas9基因编辑和Tuba-seq定量分析，并进行功能验证和机制探索。
主要模型
EGFR;p53;Cas9小鼠模型 Kras;p53;Cas9小鼠模型 人类肺腺癌患者样本和队列
重点核对
肿瘤起始后11周和19周的肿瘤生长分析 使用Lenti-sgTSPool/Cre进行多重CRISPR-Cas9基因编辑 奥希替尼治疗（25 mg/kg，每周5天，持续2周） 通过Tuba-seq定量肿瘤大小 人类队列中KEAP1通路突变与TKI治疗时间关联分析
摘要
在肺腺癌中，致癌性EGFR突变与许多肿瘤抑制基因的改变共存，但这些改变在体内对肿瘤生长和治疗反应的影响程度在很大程度上仍是未知的。通过在小鼠模型中量化十个假定肿瘤抑制基因失活对EGFR驱动的Trp53缺陷型肺腺癌的影响，我们发现Apc、Rb1或Rbm10的失活强烈促进肿瘤生长。出乎意料的是，Lkb1或Setd2的失活（在Kras驱动的模型中是生长的最强驱动因素）减少了EGFR驱动的肿瘤生长。这些结果与人类EGFR和KRAS驱动的肺腺癌的突变频率一致。此外，Keap1失活降低了EGFR驱动的肿瘤对EGFR抑制剂奥希替尼的敏感性，且KEAP1通路突变与患者接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的时间缩短相关。我们的研究强调了遗传改变的影响在不同致癌背景下如何不同，以及适应度景观在治疗时发生变化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤抑制基因失活对EGFR驱动的肺腺癌生长和治疗反应的影响及其与KRAS驱动肿瘤的差异。
- 核心机制
- EGFR驱动的肿瘤中，Apc、Rb1、Rbm10失活促进生长，而Lkb1、Setd2失活抑制生长；Keap1失活通过激活Nrf2通路降低奥希替尼敏感性。
- 主要证据
- 使用EGFR;p53;Cas9和Kras;p53;Cas9小鼠模型进行体内Tuba-seq筛选，结合人类GENIE和临床队列数据验证。
- 研究意义
- 揭示肿瘤抑制基因在不同致癌背景下的功能差异，为EGFR突变肺癌的治疗反应提供潜在的生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多重CRISPR-Cas9基因编辑和Tuba-seq分析
在体内同时评估十个肿瘤抑制基因失活对肿瘤生长的影响。
使用包含sgRNA和条形码的Lenti-sgTSPool/Cre感染EGFR;p53;Cas9小鼠，通过Tuba-seq定量各基因型肿瘤的大小。
验证Apc和Rbm10的功能
确认Apc和Rbm10失活对EGFR驱动肿瘤生长的促进作用。
单独使用Lenti-sgApc/Cre和Lenti-sgRbm10/Cre感染小鼠，14周后分析肿瘤大小和标志物。
比较EGFR和KRAS驱动下的肿瘤抑制基因功能
比较同一组肿瘤抑制基因在两种致癌背景下的功能差异。
使用相同的Tuba-seq方法分析Kras;p53;Cas9小鼠中的肿瘤生长，并与EGFR模型比较。
评估肿瘤抑制基因对奥希替尼治疗反应的影响
确定肿瘤抑制基因失活是否影响EGFR驱动肿瘤对奥希替尼的敏感性。
在EGFR;p53;Cas9小鼠中，9或17周后给予奥希替尼或对照治疗2周，通过Tuba-seq分析肿瘤大小变化。
临床队列验证
验证KEAP1通路突变与EGFR TKI治疗反应的相关性。
分析GENIE和斯坦福队列、耶鲁队列中EGFR突变肺癌患者的基因组数据和临床结果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | pCMV-VSV-G包装质粒 | Addgene | 8454 |
| pCMV-dR8.2 dvpr包装质粒 | Addgene | 8455 | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 丁酸钠 | -- | -- | |
| 病毒纯化 | 0.45 μm针头式过滤器 | Millipore | SLHP033RB |
| PCR | Q5高保真2x预混液 | New England Biolabs | M0494X |
| 文库制备 | Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 |
| 文库质量控制 | Agilent高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4626 |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | G2939BA | |
| 测序 | Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| 动物实验 | 奥希替尼 | AstraZeneca | -- |
| 多西环素 | Harlan-Teklad | -- | |
| 免疫组化 | 抗EGFRL858R抗体 | Cell Signaling Technology | 3197 |
| 抗SP-C抗体 | Abcam | AB40876 | |
| 抗TTF-1/Nkx2-1抗体 | Abcam | AB76013 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9701 | |
| 抗裂解Caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 抗mKate抗体 | Evrogen | AB233 | |
| 抗Cas9抗体 | Novus Biologicals | NBP2-36440 | |
| 抗β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8814 | |
| 抗Rbm10抗体 | Abcam | AB224149 | |
| 抗Keap1抗体 | Abcam | AB227828 | |
| 抗Sox9抗体 | Merck Millipore | AB5535 | |
| 抗Nrf2抗体 | Abcam | AB137550 | |
| 抗Nqo1抗体 | Abcam | AB28947 | |
| 抗磷酸化Erk抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗UCHL1抗体 | Sigma Millipore | HPA005993 | |
| 抗突触素抗体 | Abcam | AB32127 | |
| 抗p63抗体 | Abcam | AB124762 | |
| 组织处理 | 乙醇 | -- | -- |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| DNA提取 | 氯仿 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤起始 | 小鼠品系、病毒滴度、肿瘤发展时间 阅读提示：Methods: Mice and tumor initiation |
| CRISPR-Cas9基因编辑 | sgRNA序列、病毒载体、感染效率 阅读提示：Methods: Production, purification, and titering of lentivirus |
| Tuba-seq分析 | 条形码结构、测序平台、数据分析方法 阅读提示：Methods: Isolation of genomic DNA and preparation of sgID-BC libraries |
| 奥希替尼治疗 | 给药剂量、频率、持续时间 阅读提示：Methods: Mice and tumor initiation; Figure 5A |
| 临床数据分析 | 突变定义、队列纳入标准、统计方法 阅读提示：Methods: Analysis of human lung tumor data using GENIE data; Stanford cohort; Yale cohort |