鉴定SPHK1在TAMs中的表达及其临床相关性
确定SPHK1在CRLM中的表达模式及其与患者预后的关系。
使用免疫荧光和生物信息学分析评估人类CRC和CRLM样本中SPHK1表达；利用组织微阵列进行IHC并分析生存数据。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向巨噬细胞中的SPHK1重塑肿瘤微环境并增强结直肠癌肝转移中抗PD-1免疫治疗的疗效
Targeting SPHK1 in macrophages remodels the tumor microenvironment and enhances anti-PD-1 immunotherapy efficacy in colorectal cancer liver metastasis
实验完整度
高包含体外共培养、多个小鼠肝转移模型、CyTOF、RNA-seq、蛋白质组学及临床样本分析，并进行功能验证（敲除/抑制剂）和机制验证（信号通路）。
主要模型
MC38和CT26小鼠结肠癌肝转移模型 BMDM和THP-1来源的TAM 人类CRC组织微阵列和CRLM/CRC配对样本
重点核对
SPHK1抑制剂PF543剂量（5 mg/kg）和SKI II剂量（50 mg/kg）经腹腔注射 SPHK1−/−小鼠（C57BL/6背景）用于基因敲除实验 抗PD-1抗体（克隆RMP1-14）剂量200 μg BMDMs与MC38细胞体外共培养比例为1:1 S1P处理浓度（10 μmol/L）和NLRP3激活条件（LPS 500 ng/mL 3h，ATP 5 mmol/L 30min）
摘要
背景：结直肠癌肝转移（CRLM）的特征是免疫抑制微环境和对免疫治疗的反应迟钝。值得注意的是，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在调节免疫反应中发挥关键作用，并在CRLM中表现出显著的异质性。鞘氨醇激酶1（SPHK1）是维持神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇（S1P）水平平衡的关键激酶。然而，TAMs中SPHK1对CRLM肿瘤免疫逃逸的影响仍不清楚。本研究旨在探讨TAM内源性SPHK1在CRLM肿瘤免疫抑制微环境中的作用。方法：通过免疫荧光和生物信息学分析评估TAMs中SPHK1的表达水平。建立了几种动物模型以阐明SPHK1在体内肿瘤免疫重编程中的作用。通过流式细胞术、细胞因子测定和transwell实验研究了SPHK1在TAMs中对细胞间通讯的影响。使用RNA测序、Western blotting和实时定量聚合酶链反应探讨SPHK1激活TAMs中NLR家族pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体的分子机制。结果：我们发现SPHK1主要在TAMs中表达，并确定SPHK1+ TAMs与CRLM及人类患者免疫治疗疗效降低相关。这些SPHK1+ TAMs通过TAMs与CRC细胞之间的相互作用，诱导高表达程序性死亡受体1（PD-1）的CD8+ T细胞耗竭，表现出强免疫抑制活性。机制上，SPHK1产生的S1P发挥自分泌作用，通过核因子-κB（NF-κB）和缺氧诱导因子1亚基α（HIF-1α）信号激活TAMs中的NLRP3炎性小体和白细胞介素1β（IL-1β）释放。旁分泌的IL-1β随后上调CRC细胞中单核细胞趋化因子和ADAM金属肽酶结构域17（ADAM17）脱落酶的表达，导致肝微环境中TAM浸润和CD8+ T细胞功能障碍。此外，将靶向SPHK1的治疗与抗PD-1疗法或放射免疫治疗联合使用，在临床前小鼠模型中很大程度上阻止了肝转移，并显著延长了寿命。结论：我们的研究结果强调了TAMs的SPHK1通过促进CD8+ T细胞功能障碍和免疫抑制微环境来促进CRLM的作用。将SPHK1阻断与抗PD-1治疗联合可能是CRLM患者有希望的治疗方案。关键词：SPHK1，肿瘤相关巨噬细胞，CD8+ T细胞，结直肠癌肝转移，免疫治疗
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TAM内在的SPHK1在结直肠癌肝转移的免疫抑制微环境中发挥什么作用？
- 核心机制
- SPHK1产生的S1P以自分泌方式激活NF-κB和HIF-1α信号，上调NLRP3炎性小体并促进IL-1β释放；IL-1β旁分泌作用于CRC细胞，上调趋化因子和ADAM17，导致TAM浸润和CD8+ T细胞功能障碍。
- 主要证据
- 体内SPHK1抑制或敲除减少CRLM并改善免疫微环境；体外实验表明SPHK1通过NLRP3促进IL-1β分泌，且IL-1β刺激CRC细胞分泌ADAM17，降低CD8+ T细胞CD62L表达；临床样本分析显示SPHK1表达与不良预后相关。
- 研究意义
- SPHK1在TAM中通过促进CD8+ T细胞功能障碍和免疫抑制微环境促进CRLM进展，靶向SPHK1阻断与抗PD-1联合可能成为CRLM患者有希望的治疗方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估SPHK1抑制对CRLM进展的影响
在体内模型中检验药理学或遗传学抑制SPHK1对肝转移的影响。
在脾-肝转移模型中用SPHK1抑制剂（PF543或SKI II）处理小鼠，并与SPHK1−/−小鼠比较肝转移灶数量和大小；检测S1P水平。
分析SPHK1缺失对肝转移微环境免疫细胞组成的影响
确定SPHK1缺失是否改变TAMs和CD8+ T细胞等免疫细胞的比例和功能。
通过CyTOF、流式细胞术和IHC分析WT和SPHK1−/−小鼠肝转移瘤中免疫细胞亚群比例及CD8+ T细胞耗竭标志物。
探索SPHK1-S1P轴对TAMs中NLRP3炎性小体的激活机制
阐明SPHK1产生的S1P如何通过受体和下游信号激活NLRP3炎性小体。
用S1P处理BMDM和THP-1来源的TAM，检测NLRP3、IL-1β、Caspase1表达；使用S1PR抑制剂和激动剂鉴定受体；敲低P65和HIF-1α验证信号通路。
验证IL-1β对CRC细胞和CD8+ T细胞功能的影响
确定SPHK1+ TAM分泌的IL-1β是否通过作用于CRC细胞影响TAM募集和CD8+ T细胞功能。
用重组IL-1β处理CRC细胞，检测趋化因子表达和分泌蛋白组；在共培养体系中验证对CD8+ T细胞CD62L和PD-1表达的影响；动物实验用anakinra阻断IL-1R。
评估SPHK1靶向治疗联合抗PD-1或放疗的疗效
检测SPHK1抑制剂与免疫治疗联合的协同抗肿瘤作用。
在MC38和CT26肝转移模型中用抗PD-1抗体联合SPHK1抑制剂治疗，评估肿瘤负荷、生存期和免疫指标；在皮下+肝转移模型中联合放疗。
分析SPHK1表达与免疫治疗反应的相关性
验证SPHK1在预测免疫治疗反应中的价值。
对人类肿瘤样本（非响应者 vs 响应者）和公共数据集进行IHC和生物信息学分析，评估SPHK1表达与生存及治疗反应的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | InvivoGen | -- |
| 动物实验 | PF543 | MedChemExpress | -- |
| SKI II | MedChemExpress | -- | |
| 表达小鼠Sphk1的腺相关病毒载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| 抗CSF1R抗体克隆AFS98 | BioXcell | -- | |
| 抗CD8单克隆抗体克隆YTS 169.4 | BioXcell | -- | |
| 抗PD-1抗体（克隆RMP1-14） | BioXcell | -- | |
| 阿那白滞素 | MedChemExpress | -- | |
| 免疫荧光 | SPHK1抗体 | Proteintech | 10670-1-AP |
| 磷酸化SPHK1（Ser225）抗体 | Proteintech | 19561-1-AP | |
| CD68抗体 | Abcam | ab213363 | |
| IL-1β抗体 | Abcam | ab9722 | |
| NLRP3抗体 | Abcam | ab283819 | |
| F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 | |
| CD19抗体 | Proteintech | 66298-1-lg | |
| CD3抗体 | Proteintech | 17617-1-AP | |
| CD31抗体 | Proteintech | 66065-1-lg | |
| α平滑肌肌动蛋白抗体 | Proteintech | 67735-1-lg | |
| CD11c抗体 | Proteintech | 17342-1-AP | |
| EPCAM抗体 | Proteintech | 21050-1-AP | |
| 免疫组织化学 | SPHK1抗体 | Abmart | PK69865 |
| CD8抗体 | Abcam | ab245118 | |
| CD8抗体 | Abcam | ab209775 | |
| F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 | |
| CCL2抗体 | Proteintech | 26161-1-AP | |
| ADAM17抗体 | Huabio | ET1703-06 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| NanoDrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 反转录 | PrimeScript RT-PCR试剂盒 | TaKaRa | -- |
| qPCR | SYBR Premix Ex Taq | TaKaRa | -- |
| LightCycler 96检测系统 | Roche | -- | |
| 流式细胞术 | 胶原酶IV | Sigma-Aldrich | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I型 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ACK裂解液 | Leagene | -- | |
| IC固定缓冲液 | Biolegend | -- | |
| 胞内染色透化洗涤缓冲液 | Biolegend | -- | |
| 含布雷菲德菌素A的细胞激活混合物 | Biolegend | -- | |
| 膜联蛋白V结合缓冲液 | KeyGen BioTech | -- | |
| 质谱流式 | GentleMACS系统 | Miltenyi Biotec | -- |
| Helios CyTOF系统 | Fluidigm | -- | |
| CD8+ T细胞分离 | 抗CD8磁珠 | Miltenyi Biotec | -- |
| PBMC分离 | Histopaque®-1077 | Sigma-Aldrich | -- |
| SepMate-50 | Stemcell Technologies | -- | |
| 细胞计数 | Countess 3自动细胞计数器 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| T细胞激活 | 抗CD3抗体 | -- | -- |
| 抗CD28抗体 | -- | -- | |
| 白细胞介素-2 | Peprotech | -- | |
| 细胞处理 | 1-磷酸鞘氨醇 | Avanti Polar Lipids | -- |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 三磷酸腺苷 | InvivoGen | -- | |
| W146 | MedChemExpress | -- | |
| JET013 | MedChemExpress | -- | |
| TY52156 | MedChemExpress | -- | |
| CYM50358 | MedChemExpress | -- | |
| CYM5520 | MedChemExpress | -- | |
| 细胞转染 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- | |
| 细胞因子测定 | Bio-Plex Pro人细胞因子27-Plex免疫测定试剂盒 | BioRad | -- |
| 小鼠炎症抗体芯片C1 | Ray Biotech | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Amresco | -- |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| 增强化学发光试剂盒（FDbio-pico ECL） | Fude Bio | -- | |
| ELISA | 人或小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Dakewe | -- |
| 小鼠ADAM17 ELISA试剂盒 | Cusabio | -- | |
| 重组蛋白 | 重组IL-1β | SinoBiological | -- |
| Transwell | Transwell小室（12µm孔径） | Corning | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| RNA测序 | Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- |
| Illumina NovaSeq 6000平台 | Illumina | -- | |
| 成像 | Zeiss LSM 880共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- |
| OLYMPUS DP22显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系培养 | 细胞系来源（MC38、CT26、L929、HCT116、THP-1）及培养条件，包括培养基（DMEM或RPMI-1640）、FBS浓度、抗生素浓度、CO2浓度 阅读提示：材料与方法 2.1 Cell lines |
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6或BALB/c）、年龄（6-9周）、细胞注射数量和途径、肿瘤生长时间（3-4周） 阅读提示：材料与方法 2.4 Tumor models |
| SPHK1抑制处理 | PF543剂量（5 mg/kg）和SKI II剂量（50 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每三天一次）、起始时间（第4天） 阅读提示：材料与方法 2.5 Animal treatments |
| 联合治疗 | 抗PD-1抗体剂量（200 μg）、给药时间（第7、10、13、16天）、放疗剂量（8 Gy ×2）和时间（第6、7天） 阅读提示：材料与方法 2.5 Animal treatments |
| TAMs培养和处理 | BMDM诱导条件（20% L929条件培养基）、S1P浓度（10 μmol/L）、LPS浓度（500 ng/mL）、ATP浓度（5 mmol/L）、处理时间 阅读提示：材料与方法 2.3, 2.14 |