晚期染色质体成分TSSK2参与小鼠延长型精子细胞的翻译调控

The late chromatoid body component TSSK2 is involved in translational regulation in elongating spermatids in mice

作者信息Mari S Lehti, Lin Ma, Salli Kärnä, Samuli Laasanen, Ammar Ahmedani, Opeyemi Olotu, Matthieu Bourgery, Panyi Tran, Anu Sironen, Noora Kotaja
PMID41042594
发布时间2025-10-15
DOI10.1530/REP-25-0297

实验完整度

包含免疫荧光定位、免疫共沉淀、质谱、多聚体分析、新生蛋白标记、交联免疫沉淀、RNA-seq、原位杂交、电子显微镜等多种独立实验证据,并进行了功能验证和机制探索。

主要模型

小鼠(C57BL/6)睾丸组织 小鼠精原细胞体外培养 生精小管培养体系 TSSK2免疫沉淀复合物

重点核对

TSSK2与EIF3A、RPL24、EIF4G3的共定位(免疫荧光) TSSK2与多聚体的共分离(多糖体分级) 新生肽段在晚期-CB附近的积累(Click-iT AHA实验) TSSK2相关mRNA的鉴定(RNA-seq,n=554,log2FC≥1, P-adj≤0.05)

摘要

简而言之,时间调控的翻译对于精子发生的晚期步骤至关重要,因为在染色质凝缩过程中转录被沉默。本研究表明,胞质颗粒——晚期染色质体的功能与凝缩精子的翻译调控相关。 精子发生最终以剧烈的形态转化告终,包括染色质的紧密压缩和核重塑,这很大程度上使转录沉默。由于转录沉默,形态转化所需的精子特异性蛋白质的产生,需要早期细胞类型中转录的mRNA的活性储存和翻译调控。生殖系特异性核糖核蛋白(RNP)颗粒,即染色质体(CB),积累RNA并在早期单倍体细胞(圆形精子细胞)的RNA调控中发挥作用。在晚期单倍体细胞(延长型精子细胞)中,CB转变为所谓的晚期-CB,其在RNA调控中的功能一直不明确。这里我们通过鉴定与已知晚期-CB标记物睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(TSSK2)相互作用的蛋白质和RNA,来表征晚期-CB的功能。我们表明TSSK2和晚期-CB与翻译起始因子和核糖体蛋白相关。此外,我们揭示了TSSK2与一组特定的mRNA相关,这些mRNA在延长型精子细胞中富集于多聚体组分,支持晚期-CB在时间调控翻译中的作用。这些结果首次将晚期-CB的功能与晚期精子发生过程中的RNA调控联系起来,为精子发生和雄性生育所需的RNA调控过程提供了重要的新信息。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
晚期染色质体在延长型精子细胞中是否参与RNA调控和翻译调控?
核心机制
TSSK2作为晚期-CB标志物,与翻译起始因子EIF3复合物、核糖体蛋白及一组特定mRNA结合,可能通过时空调节mRNA的翻译来支持精子尾部和附属结构的形成。
主要证据
通过质谱鉴定TSSK2相互作用蛋白(288个),其中包含翻译因子和核糖体蛋白;RNA-seq鉴定554个TSSK2相关mRNA,其中355个也存在于DDX4阳性CB中;多聚体分析显示TSSK2与多聚体共分离,且相关mRNA富集于延长型精子细胞的多聚体组分;新生肽段标记显示翻译活性与晚期-CB相关。
研究意义
首次将晚期-CB的功能与RNA调控联系起来,揭示了晚期精子发生中mRNA调控的新机制,为理解精子发生和雄性生育提供关键信息,并可能为男性不育的诊断和治疗提供潜在靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

TSSK2在精子发生中的定位动态

确定TSSK2在延长型精子细胞中的亚细胞定位及其与晚期-CB结构的关系

对成年小鼠睾丸切片进行免疫荧光染色,观察TSSK2在不同阶段精子细胞中的分布,包括晚期-CB环和卫星结构

2

TSSK2互作蛋白的鉴定与验证

鉴定TSSK2相互作用蛋白,探究晚期-CB的分子组成

通过免疫共沉淀(co-IP)从睾丸裂解液中富集TSSK2复合物,用质谱鉴定互作蛋白,并用Western blot验证关键相互作用

3

TSSK2与翻译因子的共定位分析

验证TSSK2与翻译相关蛋白在细胞内的共定位

对睾丸切片进行TSSK2与EIF3A、RPL24、EIF4G3的双重免疫荧光染色,观察它们在晚期-CB区域的分布

4

TSSK2与翻译活性的关联评估

评估TSSK2是否与活跃的翻译过程相关

采用多聚体分析检测TSSK2在多聚体组分中的分布;利用生精小管培养和Click-iT AHA标记检测新生蛋白合成位置

5

TSSK2相关mRNA的鉴定

确定TSSK2结合的mRNA种类

通过交联免疫沉淀(CLIP)方法纯化TSSK2-RNA复合物,提取RNA并进行RNA测序,鉴定TSSK2特异性关联的mRNA

6

TSSK2相关mRNA的功能分析

分析TSSK2相关mRNA的表达模式和功能类别

利用公开数据集分析这些mRNA在不同生殖细胞类型中的表达,并通过GO富集和DAVID功能分类了解其潜在功能

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
TSSK2抗体AbnovaH00023617-M01
SPATA19抗体ProteinTech16656-1-AP
MIWI抗体Cell Signaling Technology2079S
EIF3A抗体Nordic BioSiteBT-E1F0D7
RPL24抗体ProteinTech17082-1-AP
EIF4G3抗体Bethyl LaboratoriesA301-769A
CAS封闭液Invitrogen00-8120
免疫组化抗体稀释液BD Pharmingen559148
DAPI----
含DAPI的Vectashield封片剂Vector LaboratoriesH-1200-10
3i CSU-W1转盘共聚焦显微镜Intelligent Imaging Innovations--
Photometric Prime BSI sCMOS相机----
蔡司Plan-Apochromat 63x/1.4油浸物镜Zeiss--
DMEM培养基Gibco21013024
Click-iT AHA Alexa Fluor 488蛋白合成检测试剂盒Thermo Fisher ScientificC10289
Dynabeads蛋白G磁珠Thermo Fisher Scientific10003D
Mini-PROTEAN TGX预制胶Bio-Rad4561093
Trans-Blot Turbo转印包Bio-Rad1704156
EveryBlot封闭液Bio-Rad12010020
Western Lightning ECL Pro化学发光试剂盒PerkinElmerNEL120E001EA
Sapphire生物分子成像仪Azure Biosystems--
Easy-nLC1200纳升液相色谱系统Thermo Fisher Scientific--
Q Exactive HF质谱仪Thermo Fisher Scientific--
C18色谱柱(ReproSil-Pur)Dr Maisch HPLC GmbH--
RiboLock RNA酶抑制剂Thermo ScientificEO0382
TissueLyser LT组织研磨器Qiagen--
SW 32.1 Ti转子Beckman Coulter369651
开口薄壁超清晰离心管Beckman CoulterC14297
NanoDrop ND-1000分光光度计Thermo Scientific--
I型胶原酶WorthingtonLS004196
Bioruptor UCD-200超声破碎仪Diagenode--
TRIsure RNA提取试剂BiolineBIO-38033
Bioanalyzer RNA 6000 Pico检测试剂盒Agilent--
2100生物分析仪Agilent--
Illumina NovaSeq 6000测序平台Illumina--
RNAscope多重荧光试剂盒v2Advanced Cell Diagnostics--
ProLong Gold抗淬灭封片剂Thermo Fisher--
JEM-1400 Plus透射电子显微镜JEOL--
OSIS Quemesa 11 mPix相机OSIS--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
免疫荧光
小鼠品系、年龄、固定条件、抗体浓度、抗原修复条件
阅读提示:见Material and methods中'Immunofluorescence and imaging'小节
生精小管培养
培养基、AHA浓度、CHX浓度、处理时间、温度及CO2水平
阅读提示:见Material and methods中'Seminiferous tubule culture and translation assay'
免疫共沉淀
裂解液成分、抗体类型及用量、裂解条件、清洗步骤
阅读提示:见Material and methods中'Co-immunoprecipitation and western blotting'
质谱分析
样品数量、色谱梯度、质谱参数、数据库版本、肽段阈值
阅读提示:见Material and methods中'Mass spectrometry'
多聚体分析
蔗糖梯度范围、超速离心条件、缓冲液成分、检测方法
阅读提示:见Material and methods中'Polysome fractionation'
交联免疫沉淀
交联剂浓度和交联时间、细胞裂解条件、超声参数、抗体使用
阅读提示:见Material and methods中'Cross-linking and immunoprecipitation of RNA-protein complexes'
RNA-seq
文库构建、测序平台、数据分析参数、差异表达阈值
阅读提示:见Material and methods中'RNA sequencing and data analysis'
原位杂交
探针序列、杂交和洗涤温度、显色试剂、成像参数
阅读提示:见Material and methods中'In situ hybridization'