TSSK2在精子发生中的定位动态
确定TSSK2在延长型精子细胞中的亚细胞定位及其与晚期-CB结构的关系
对成年小鼠睾丸切片进行免疫荧光染色,观察TSSK2在不同阶段精子细胞中的分布,包括晚期-CB环和卫星结构
The late chromatoid body component TSSK2 is involved in translational regulation in elongating spermatids in mice
包含免疫荧光定位、免疫共沉淀、质谱、多聚体分析、新生蛋白标记、交联免疫沉淀、RNA-seq、原位杂交、电子显微镜等多种独立实验证据,并进行了功能验证和机制探索。
小鼠(C57BL/6)睾丸组织 小鼠精原细胞体外培养 生精小管培养体系 TSSK2免疫沉淀复合物
TSSK2与EIF3A、RPL24、EIF4G3的共定位(免疫荧光) TSSK2与多聚体的共分离(多糖体分级) 新生肽段在晚期-CB附近的积累(Click-iT AHA实验) TSSK2相关mRNA的鉴定(RNA-seq,n=554,log2FC≥1, P-adj≤0.05)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定TSSK2在延长型精子细胞中的亚细胞定位及其与晚期-CB结构的关系
对成年小鼠睾丸切片进行免疫荧光染色,观察TSSK2在不同阶段精子细胞中的分布,包括晚期-CB环和卫星结构
鉴定TSSK2相互作用蛋白,探究晚期-CB的分子组成
通过免疫共沉淀(co-IP)从睾丸裂解液中富集TSSK2复合物,用质谱鉴定互作蛋白,并用Western blot验证关键相互作用
验证TSSK2与翻译相关蛋白在细胞内的共定位
对睾丸切片进行TSSK2与EIF3A、RPL24、EIF4G3的双重免疫荧光染色,观察它们在晚期-CB区域的分布
评估TSSK2是否与活跃的翻译过程相关
采用多聚体分析检测TSSK2在多聚体组分中的分布;利用生精小管培养和Click-iT AHA标记检测新生蛋白合成位置
确定TSSK2结合的mRNA种类
通过交联免疫沉淀(CLIP)方法纯化TSSK2-RNA复合物,提取RNA并进行RNA测序,鉴定TSSK2特异性关联的mRNA
分析TSSK2相关mRNA的表达模式和功能类别
利用公开数据集分析这些mRNA在不同生殖细胞类型中的表达,并通过GO富集和DAVID功能分类了解其潜在功能
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | TSSK2抗体 | Abnova | H00023617-M01 |
| SPATA19抗体 | ProteinTech | 16656-1-AP | |
| MIWI抗体 | Cell Signaling Technology | 2079S | |
| EIF3A抗体 | Nordic BioSite | BT-E1F0D7 | |
| RPL24抗体 | ProteinTech | 17082-1-AP | |
| EIF4G3抗体 | Bethyl Laboratories | A301-769A | |
| CAS封闭液 | Invitrogen | 00-8120 | |
| 免疫组化抗体稀释液 | BD Pharmingen | 559148 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| 显微成像 | 3i CSU-W1转盘共聚焦显微镜 | Intelligent Imaging Innovations | -- |
| Photometric Prime BSI sCMOS相机 | -- | -- | |
| 蔡司Plan-Apochromat 63x/1.4油浸物镜 | Zeiss | -- | |
| 生精小管培养 | DMEM培养基 | Gibco | 21013024 |
| Click-iT AHA Alexa Fluor 488蛋白合成检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10289 | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads蛋白G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10003D |
| Western blotting | Mini-PROTEAN TGX预制胶 | Bio-Rad | 4561093 |
| Trans-Blot Turbo转印包 | Bio-Rad | 1704156 | |
| EveryBlot封闭液 | Bio-Rad | 12010020 | |
| Western Lightning ECL Pro化学发光试剂盒 | PerkinElmer | NEL120E001EA | |
| Sapphire生物分子成像仪 | Azure Biosystems | -- | |
| 质谱分析 | Easy-nLC1200纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18色谱柱(ReproSil-Pur) | Dr Maisch HPLC GmbH | -- | |
| 多聚体分析 | RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Scientific | EO0382 |
| TissueLyser LT组织研磨器 | Qiagen | -- | |
| SW 32.1 Ti转子 | Beckman Coulter | 369651 | |
| 开口薄壁超清晰离心管 | Beckman Coulter | C14297 | |
| NanoDrop ND-1000分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| 交联和免疫沉淀 | I型胶原酶 | Worthington | LS004196 |
| Bioruptor UCD-200超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| RNA提取 | TRIsure RNA提取试剂 | Bioline | BIO-38033 |
| RNA分析 | Bioanalyzer RNA 6000 Pico检测试剂盒 | Agilent | -- |
| 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| RNA-seq | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 原位杂交 | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 电子显微镜 | JEM-1400 Plus透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| OSIS Quemesa 11 mPix相机 | OSIS | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫荧光 | 小鼠品系、年龄、固定条件、抗体浓度、抗原修复条件 阅读提示:见Material and methods中'Immunofluorescence and imaging'小节 |
| 生精小管培养 | 培养基、AHA浓度、CHX浓度、处理时间、温度及CO2水平 阅读提示:见Material and methods中'Seminiferous tubule culture and translation assay' |
| 免疫共沉淀 | 裂解液成分、抗体类型及用量、裂解条件、清洗步骤 阅读提示:见Material and methods中'Co-immunoprecipitation and western blotting' |
| 质谱分析 | 样品数量、色谱梯度、质谱参数、数据库版本、肽段阈值 阅读提示:见Material and methods中'Mass spectrometry' |
| 多聚体分析 | 蔗糖梯度范围、超速离心条件、缓冲液成分、检测方法 阅读提示:见Material and methods中'Polysome fractionation' |
| 交联免疫沉淀 | 交联剂浓度和交联时间、细胞裂解条件、超声参数、抗体使用 阅读提示:见Material and methods中'Cross-linking and immunoprecipitation of RNA-protein complexes' |
| RNA-seq | 文库构建、测序平台、数据分析参数、差异表达阈值 阅读提示:见Material and methods中'RNA sequencing and data analysis' |
| 原位杂交 | 探针序列、杂交和洗涤温度、显色试剂、成像参数 阅读提示:见Material and methods中'In situ hybridization' |