临床和遗传学鉴定
鉴定两个法国家系中导致迟发性远端肌病的致病基因变异。
对两个家系进行临床评估、肌肉影像学检查、全基因组连锁分析、外显子组测序和Sanger测序，鉴定出TARDBP基因中的G376V变异。
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新型错义突变G376V-TDP-43诱导迟发性远端肌病但不引起肌萎缩侧索硬化
The new missense G376V-TDP-43 variant induces late-onset distal myopathy but not amyotrophic lateral sclerosis
实验完整度
高包含临床队列、肌肉活检病理、细胞模型功能验证、体外相分离和聚集实验、患者来源细胞及组织验证等多层级证据。
主要模型
HEK293T细胞 U2OS细胞 患者来源成肌细胞和肌管 重组TDP-43蛋白
重点核对
G376V变异在Family A和Family B中的共分离 G376V变异在gnomAD等数据库中的缺失 HEK293T细胞中sarkosyl不溶性TDP-43的比例 患者肌肉组织中ACSF2、GPSM2和POLDIP3基因的异常剪接
摘要
TAR DNA结合蛋白43 kDa（TDP-43）阳性神经元包涵体是多种神经退行性疾病的标志，包括由致病性TARDBP变异引起的家族性肌萎缩侧索硬化（fALS）以及更常见的非孟德尔遗传的散发性ALS（sALS）。本文报道了两个法国家系中TDP-43 C末端朊病毒样结构域的一个G376V-TDP-43错义变异，这两个家系患有常染色体显性遗传性肌病，但不符合ALS的诊断标准。两个家系的患者均表现为进行性远端肌肉无力和萎缩，起病年龄在50至70岁之间。肌肉活检显示退行性肌病特征，表现为镶边（自噬）空泡积聚、肌节完整性破坏和严重的肌原纤维结构紊乱。G376V变异改变了一个高度保守的氨基酸残基，并且在人类基因组变异数据库中不存在。变异致病性得到计算机分析和功能研究的支持。G376V突变体在细胞培养模型中增加了细胞质TDP-43凝聚体的形成，促进了体外高分子量寡聚体和聚集体的组装，并改变了由相分离产生的TDP-43凝聚体的形态。此外，该变异导致患者来源的成肌细胞中形成细胞质TDP-43凝聚体，并在患者肌肉组织中诱导异常mRNA剪接。鉴定出患有TDP-43相关肌病但非ALS的个体，暗示TARDBP错义变异可能比先前预期的具有更多多效性效应，并支持TDP-43在骨骼肌病理生理学中的主要作用。我们建议在迟发性远端肌病患者的遗传学检查中纳入TARDBP筛查。需要进一步研究以阐明导致神经退行性或肌病表型的TARDBP变异的确切致病机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TARDBP基因错义变异是否也能导致原发性骨骼肌疾病而不伴有ALS？
- 核心机制
- G376V变异位于TDP-43 C端朊病毒样结构域，增强TDP-43的相分离和聚集倾向，导致细胞质中形成异常凝聚体，并损害其RNA剪接抑制功能，从而引起肌肉病理。
- 主要证据
- 两个法国家系中G376V变异与常染色体显性迟发性远端肌病共分离；患者肌肉活检显示镶边空泡和TDP-43阳性包涵体；细胞和体外实验表明G376V增强TDP-43聚集；患者肌肉组织中检测到ACSF2、GPSM2和POLDIP3的异常剪接。
- 研究意义
- 研究支持TDP-43在骨骼肌病理生理学中的直接作用，并建议将TARDBP筛查纳入迟发性远端肌病患者的遗传学检查。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肌肉活检病理分析
评估患者肌肉组织的组织病理学特征。
对3例患者的肌肉活检进行组织化学染色、免疫组化和透射电子显微镜检查，发现镶边空泡、SQSTM1/p62和磷酸化TDP-43阳性包涵体以及肌原纤维结构紊乱。
细胞模型验证聚集倾向
验证G376V变异对TDP-43蛋白溶解性和聚集的影响。
在HEK293T细胞中过表达HA标记的野生型或G376V TDP-43，进行sarkosyl分级分离和免疫印迹分析。
体外相分离和聚集实验
研究G376V变异对TDP-43相分离和聚集动力学的影响。
纯化重组TDP-43-MBP-His6蛋白，通过TEV蛋白酶切割MBP标签诱导相分离，使用浊度测量、相差显微镜和SDD-AGE监测凝聚体形成和聚集。
患者来源细胞验证
在患者来源的肌肉细胞中验证G376V变异对TDP-43凝聚体和RNA剪接的影响。
从患者和对照个体分离成肌细胞和肌管，用山梨醇诱导渗透压应激，通过免疫荧光检查细胞质TDP-43凝聚体；通过RT-PCR检测肌肉组织中的异常剪接。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- |
| 青霉素/链霉素 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DMEM/F12 GlutaMAX培养基 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 非必需氨基酸培养基 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| M199培养基 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胎球蛋白 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| β-成纤维细胞生长因子 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 表皮生长因子 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰岛素 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 马血清 | Gibco-Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | Fugene HD转染试剂 | Promega | -- |
| 药物处理 | D-山梨醇 | Euromedex | -- |
| Western blot | 抗TDP-43抗体 | Proteintech | 12892-1-AP |
| 抗TDP-43抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| 免疫组织化学 | 抗磷酸化TDP-43抗体 | Cosmo Bio | TIP-PTD-P02 |
| 抗SQSTM1/p62抗体 | BD Biosciences | 610833 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | mAb#2118 |
| 抗HA抗体 | Merck | 11867423001 | |
| 抗兔二抗 | GE Healthcare UK | NA934 | |
| 抗大鼠二抗 | Santa Cruz | sc-2956 | |
| 免疫荧光 | 驴抗兔Alexa-Fluor 488二抗 | Molecular Probe | A21206 |
| 组织化学 | Gomori三色染色 | -- | -- |
| NADH-四唑还原酶反应 | -- | -- | |
| 细胞色素c氧化酶反应 | -- | -- | |
| 透射电子显微镜 | 环氧丙烷 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | -- |
| Epon环氧树脂 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | -- | |
| 醋酸铀酰 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| 外显子组测序 | SureSelect人类全外显子50Mb试剂盒v4 | Agilent | -- |
| Sanger测序 | BigDye Terminator循环测序试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Immu-Mount™封片剂 | Thermo Scientific | -- | |
| FluorSave™封片剂 | Millipore | -- | |
| 细胞裂解 | N-月桂酰肌氨酸钠 | -- | -- |
| Complete EDTA-free蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| PhosphoStop磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| TBS-Tween缓冲液 | Interchim | -- | |
| ECL-prime检测试剂盒 | GE Healthcare | -- | |
| ChemiDoc™ Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Image Lab软件 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白纯化 | 咪唑 | -- | -- |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| 抑肽酶 | -- | -- | |
| 亮抑酶肽半硫酸盐 | -- | -- | |
| 胃蛋白酶抑制剂A | -- | -- | |
| TCEP | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和转染 | HEK293T细胞密度（400,000细胞/孔）、转染DNA量（1-2μg）、Fugene HD试剂使用、转染后分析时间（48-72小时） 阅读提示：Methods: Transient and stable transfections |
| sarkosyl分级分离和免疫印迹 | 裂解缓冲液组成（含1% sarkosyl）、超速离心条件（100,000g 30分钟）、抗HA和抗GAPDH抗体稀释度 阅读提示：Methods: Sarkosyl fractionation and immunoblotting |
| 体外相分离和聚集实验 | 重组蛋白浓度（2.5、5、10μM）、TEV蛋白酶切割、浊度测量、凝聚体形态观察、SDD-AGE时间过程（0-5天） 阅读提示：Methods: In vitro phase separation and aggregation assays |
| 患者来源细胞实验 | 成肌细胞和肌管培养条件、山梨醇处理浓度（400mM）和时间（1-3小时）、免疫荧光染色条件（抗TDP-43抗体10782-2-AP 1:500） 阅读提示：Methods: Cell culture, Induction of osmotic stress, Direct fluorescence and immunofluorescence confocal microscopy imaging |
| RNA剪接分析 | RT-PCR检测基因（ACSF2、GPSM2、POLDIP3和EIF4G2）、TDP-43敲低SH-SY5Y细胞作为阳性对照、患者肌肉组织样本 阅读提示：Results: Altered pre-mRNA splicing occurs in patient-derived G376V mutant muscle tissue |